大鼠脂肪來源血管內(nèi)皮細(xì)胞的改良式培養(yǎng)與生物學(xué)特性的初步研究.pdf

1、目的:
　　基于目前各種血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascularendothelialcells,VECs)的培養(yǎng)方法還存在一些問題,如取材困難、操作復(fù)雜、周期長、細(xì)胞量小、不能反復(fù)傳代、經(jīng)濟(jì)成本高等。本研究通過對傳統(tǒng)酶消化法獲取血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法進(jìn)行改良,探討此方法可以解決傳統(tǒng)方法的部分問題,并初步研究VECs的生物學(xué)特性,還對與VECs具有協(xié)同作用的脂肪來源干細(xì)胞(adipose-derivedstemcells,ADSCs)進(jìn)行了基礎(chǔ)

2、研究,為后續(xù)脂肪移植血管化與脂肪組織工程血管化研究篩選性能良好的種子細(xì)胞奠定一定的細(xì)胞基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.脂肪來源血管內(nèi)皮細(xì)胞的初步提取:采用膠原酶消化SD大鼠睪丸囊脂肪組織,以改良式方法(去除脂肪筋膜組織、保留微血管、減少膠原酶消化時間)初步獲取脂肪來源血管內(nèi)皮細(xì)胞。
　　2.細(xì)胞的純化與擴(kuò)增:通過酶消化法人工純化、擴(kuò)增血管內(nèi)皮細(xì)胞。
　　3.生物學(xué)特性檢測:通過倒置顯微鏡觀察凍存前與復(fù)蘇后(凍存于液氮

3、中12個月)的P3及P15代VECs細(xì)胞后觀察細(xì)胞形態(tài)及貼壁時間有無明顯差異;采用MTT比色法檢測細(xì)胞的增殖狀況。
　　4.鑒定:流式細(xì)胞儀(FCM)檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物CD31、CD29及第Ⅷ因子相關(guān)抗原,以明確分離培養(yǎng)的細(xì)胞為VECs。
　　5.活體移植:將血管內(nèi)皮細(xì)胞混懸液局部皮內(nèi)注射移植入大鼠皮膚創(chuàng)面,與對照組比較創(chuàng)面愈合率。
　　6.脂肪來源干細(xì)胞的培養(yǎng):依據(jù)傳統(tǒng)方法分離、純化、擴(kuò)增ADSCs;通過流式細(xì)胞儀檢

4、測細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29、CD31及CD44;體外誘導(dǎo)ADSCs向成骨細(xì)胞及成脂細(xì)胞分化,采用茜素紅及油紅O染色鑒定,證實(shí)ADSCs具有成骨和成脂的多向分化能力。
　　7.脂肪來源干細(xì)胞的體內(nèi)示蹤:體外觀察CM-DiI標(biāo)記后ADSCs的細(xì)胞形態(tài);檢測體內(nèi)移植CM-DiI標(biāo)記的ADSCs后24h及5d的示蹤效果。
　　結(jié)果:
　　1.采用改良式分離VECs的方法,成功獲取大鼠VECs。
　　2.觀察原代及傳代VEC

5、s細(xì)胞形態(tài)及生長情況無明顯差異,MTT比色法檢測細(xì)胞的增殖率,長期凍存復(fù)蘇后仍能夠保持良好的生物學(xué)特性。
　　3.流式細(xì)胞儀(FCM)檢測CD31及第Ⅷ因子相關(guān)抗原均較高表達(dá),初步明確分離培養(yǎng)的細(xì)胞為VECs。
　　4.將VECs移植入大鼠皮膚創(chuàng)面,與對照組相比,無明顯促愈和作用。
　　5.依據(jù)傳統(tǒng)方法分離培養(yǎng)的ADSCs,細(xì)胞生長良好;經(jīng)成骨和成脂誘導(dǎo)后,具有定向分化為骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞能力;CM-DiI能標(biāo)記體外培養(yǎng)