模擬失重對(duì)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響.pdf

1、目的：
　　 失重或模擬失重可導(dǎo)致肺循環(huán)功能失調(diào)，血管結(jié)構(gòu)、功能的變化在其中具有重要作用。肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能對(duì)于肺循環(huán)的正常功能維持具有重要作用，是構(gòu)成微血管通透性的主要物理屏障，不僅能保證微血管內(nèi)外正常的物質(zhì)交換，而且可分泌多種因子調(diào)節(jié)微血管的舒縮功能。失重或模擬失重后肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能變化及其內(nèi)在機(jī)制并不清楚。因此，本課題的目的為：
　　 （1）觀察回轉(zhuǎn)模擬失重對(duì)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響：
　　

2、 （2）研究回轉(zhuǎn)模擬失重對(duì)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞合成NO產(chǎn)量及eNOS蛋白表達(dá)的影響；
　　 （3）研究回轉(zhuǎn)模擬失重對(duì)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架的影響；
　　 （4）研究回轉(zhuǎn)模擬失重對(duì)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響初步分子機(jī)制。
　　 方法
　　 采用組織塊貼壁法培養(yǎng)原代肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞，以倒置相差顯微鏡、Ⅷ因子免疫熒光染色、掃描電鏡和透射電鏡等方法對(duì)培養(yǎng)的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行鑒定；采用回轉(zhuǎn)器回轉(zhuǎn)細(xì)胞模擬失重，以掃描電

3、鏡和透射電鏡法對(duì)回轉(zhuǎn)模擬失重后肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行觀察：以Griess法對(duì)培養(yǎng)的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞合成釋放的NO濃度進(jìn)行檢測(cè)，以免疫組化技術(shù)和Western blot技術(shù)對(duì)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的eNOS蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)：以Annexin V-FITC和PI雙染標(biāo)記細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)及Hoechst33258細(xì)胞核染色對(duì)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測(cè)：采用免疫熒光標(biāo)記技術(shù)，以Texas Red-X偶聯(lián)的phalloidin標(biāo)記肺

4、微血管內(nèi)皮細(xì)胞微絲肌動(dòng)蛋白，觀察回轉(zhuǎn)模擬失重對(duì)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架的影響；采用放免技術(shù)檢測(cè)回轉(zhuǎn)模擬失重后肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞ET-1合成釋放量的變化，以Western blot技術(shù)和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞Akt磷酸化水平的變化及P21Cip1蛋白表達(dá)的變化；采用Western blot技術(shù)對(duì)凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。
　　 結(jié) 果
　　 掃描電鏡結(jié)果表明，回轉(zhuǎn)48h后，肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞單層細(xì)胞之

5、間的連接較為松散，可見有明顯的裂縫存在；而在同步對(duì)照組的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞單層可見細(xì)胞之間的連接較為緊密，未見裂縫或空洞存在，說明回轉(zhuǎn)模擬失重能夠破壞肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞單層，導(dǎo)致肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞單層的通透性明顯增強(qiáng)。透射電鏡結(jié)果表明，回轉(zhuǎn)48小時(shí)后，可見肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中線粒體增生、腫脹。NO檢測(cè)及Western blot、免疫組化結(jié)果表明，回轉(zhuǎn)模擬失重可導(dǎo)致肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的NO產(chǎn)量增加，同時(shí)增強(qiáng)eNOS蛋白的表達(dá)，并且這種增加存在時(shí)間依

6、賴關(guān)系。Hoechst33258染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，回轉(zhuǎn)48h模擬失重肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照；phalloidin肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞微絲肌動(dòng)蛋白染色結(jié)果表明，回轉(zhuǎn)模擬失重可導(dǎo)致微絲細(xì)胞骨架隨著回轉(zhuǎn)時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)進(jìn)行性的解聚；回轉(zhuǎn)48h后，放免結(jié)果表明肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞合成釋放ET-1的量下降：Western blot及免疫熒光染色結(jié)果表明，Akt磷酸化水平下降，而P21Cip1蛋白表達(dá)增強(qiáng)：Western blot檢測(cè)

7、凋亡相關(guān)蛋白結(jié)果表明，回轉(zhuǎn)模擬失重后肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著下降，而促凋亡蛋白Bax表達(dá)顯著升高。
　　 結(jié) 論
　　 （1）回轉(zhuǎn)模擬失重可導(dǎo)致肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中線粒體增生、腫脹：破壞肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞單層，導(dǎo)致肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞單層的通透性明顯增強(qiáng)；
　　 （2）回轉(zhuǎn)模擬失重可刺激肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中NO的合成和釋放，增強(qiáng)eNOS蛋白的表達(dá)，并且這種eNOS表達(dá)的增強(qiáng)和NO產(chǎn)量的增加與回轉(zhuǎn)模擬失