模擬失重對肺微血管內(nèi)皮細胞的影響.pdf

1、目的：
　　 失重或模擬失重可導致肺循環(huán)功能失調(diào)，血管結(jié)構(gòu)、功能的變化在其中具有重要作用。肺微血管內(nèi)皮細胞功能對于肺循環(huán)的正常功能維持具有重要作用，是構(gòu)成微血管通透性的主要物理屏障，不僅能保證微血管內(nèi)外正常的物質(zhì)交換，而且可分泌多種因子調(diào)節(jié)微血管的舒縮功能。失重或模擬失重后肺微血管內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)、功能變化及其內(nèi)在機制并不清楚。因此，本課題的目的為：
　　 （1）觀察回轉(zhuǎn)模擬失重對肺微血管內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)的影響：
　　

2、 （2）研究回轉(zhuǎn)模擬失重對肺微血管內(nèi)皮細胞合成NO產(chǎn)量及eNOS蛋白表達的影響；
　　 （3）研究回轉(zhuǎn)模擬失重對肺微血管內(nèi)皮細胞骨架的影響；
　　 （4）研究回轉(zhuǎn)模擬失重對肺微血管內(nèi)皮細胞凋亡的影響初步分子機制。
　　 方法
　　 采用組織塊貼壁法培養(yǎng)原代肺微血管內(nèi)皮細胞，以倒置相差顯微鏡、Ⅷ因子免疫熒光染色、掃描電鏡和透射電鏡等方法對培養(yǎng)的肺微血管內(nèi)皮細胞進行鑒定；采用回轉(zhuǎn)器回轉(zhuǎn)細胞模擬失重，以掃描電

3、鏡和透射電鏡法對回轉(zhuǎn)模擬失重后肺微血管內(nèi)皮細胞的超微結(jié)構(gòu)變化進行觀察：以Griess法對培養(yǎng)的肺微血管內(nèi)皮細胞合成釋放的NO濃度進行檢測，以免疫組化技術和Western blot技術對肺微血管內(nèi)皮細胞中的eNOS蛋白表達進行檢測：以Annexin V-FITC和PI雙染標記細胞，采用流式細胞術及Hoechst33258細胞核染色對肺微血管內(nèi)皮細胞凋亡進行檢測：采用免疫熒光標記技術，以Texas Red-X偶聯(lián)的phalloidin標記肺

4、微血管內(nèi)皮細胞微絲肌動蛋白，觀察回轉(zhuǎn)模擬失重對肺微血管內(nèi)皮細胞骨架的影響；采用放免技術檢測回轉(zhuǎn)模擬失重后肺微血管內(nèi)皮細胞ET-1合成釋放量的變化，以Western blot技術和免疫熒光技術檢測肺微血管內(nèi)皮細胞Akt磷酸化水平的變化及P21Cip1蛋白表達的變化；采用Western blot技術對凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2和Bax的表達進行檢測。
　　 結(jié) 果
　　 掃描電鏡結(jié)果表明，回轉(zhuǎn)48h后，肺微血管內(nèi)皮細胞單層細胞之

5、間的連接較為松散，可見有明顯的裂縫存在；而在同步對照組的肺微血管內(nèi)皮細胞單層可見細胞之間的連接較為緊密，未見裂縫或空洞存在，說明回轉(zhuǎn)模擬失重能夠破壞肺微血管內(nèi)皮細胞單層，導致肺微血管內(nèi)皮細胞單層的通透性明顯增強。透射電鏡結(jié)果表明，回轉(zhuǎn)48小時后，可見肺微血管內(nèi)皮細胞中線粒體增生、腫脹。NO檢測及Western blot、免疫組化結(jié)果表明，回轉(zhuǎn)模擬失重可導致肺微血管內(nèi)皮細胞的NO產(chǎn)量增加，同時增強eNOS蛋白的表達，并且這種增加存在時間依

6、賴關系。Hoechst33258染色及流式細胞術檢測結(jié)果表明，回轉(zhuǎn)48h模擬失重肺微血管內(nèi)皮細胞凋亡率明顯高于對照；phalloidin肺微血管內(nèi)皮細胞微絲肌動蛋白染色結(jié)果表明，回轉(zhuǎn)模擬失重可導致微絲細胞骨架隨著回轉(zhuǎn)時間的延長出現(xiàn)進行性的解聚；回轉(zhuǎn)48h后，放免結(jié)果表明肺微血管內(nèi)皮細胞合成釋放ET-1的量下降：Western blot及免疫熒光染色結(jié)果表明，Akt磷酸化水平下降，而P21Cip1蛋白表達增強：Western blot檢測

7、凋亡相關蛋白結(jié)果表明，回轉(zhuǎn)模擬失重后肺微血管內(nèi)皮細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表達顯著下降，而促凋亡蛋白Bax表達顯著升高。
　　 結(jié) 論
　　 （1）回轉(zhuǎn)模擬失重可導致肺微血管內(nèi)皮細胞中線粒體增生、腫脹：破壞肺微血管內(nèi)皮細胞單層，導致肺微血管內(nèi)皮細胞單層的通透性明顯增強；
　　 （2）回轉(zhuǎn)模擬失重可刺激肺微血管內(nèi)皮細胞中NO的合成和釋放，增強eNOS蛋白的表達，并且這種eNOS表達的增強和NO產(chǎn)量的增加與回轉(zhuǎn)模擬失