脫氫表雄酮對(duì)兔骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)學(xué)改善作用機(jī)制的研究.pdf

1、骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是多種因素共同作用下所致的退行性關(guān)節(jié)疾病，主要表現(xiàn)是關(guān)節(jié)疼痛和活動(dòng)受限，最終導(dǎo)致患者活動(dòng)能力下降甚至喪失。OA在老年人群中的發(fā)病率很高，據(jù)報(bào)道，我國(guó)60歲以上人群中，OA的發(fā)病率達(dá)50％，而75歲以上人群中，其發(fā)病率高達(dá)80％，且近年來(lái)OA的發(fā)病率和致殘率仍在不斷升高。此外，由于疾病早期缺乏癥狀而不易察覺，當(dāng)出現(xiàn)明顯癥狀時(shí)疾病多進(jìn)入中晚期，軟骨已發(fā)生不可逆性損害。因此多數(shù)患者因?yàn)樘弁?、關(guān)節(jié)功

2、能喪失而不得不接受人工關(guān)節(jié)置換手術(shù)。由此可見，OA已經(jīng)成為威脅老年人群公共健康和生活質(zhì)量的重大醫(yī)學(xué)問(wèn)題。
　　蛋白聚糖酶(aggrecanase)是近幾年最新克隆分離出的酶類，是帶有血小板凝血酶敏感蛋白樣模體的解整鏈蛋白金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinasewith thrombospondin motifs，ADAMTS)家族成員。近期研究發(fā)現(xiàn)aggrecanase-1（ADAMTS-

3、4）與aggrecanse-2（ADAMTS-5），OA疾病早期就參與了軟骨蛋白聚糖(aggrecan)的降解，與疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系，而同時(shí)抑制ADAMTS-4和ADAMTS-5可以有效防止OA軟骨細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降解，防止軟骨的退行性變。組織因子機(jī)制金屬蛋白酶抑制劑-3（tissue inhibitor of metalloproteinases-3，TIMP-3）已被證明對(duì)于ADAMTS-4/5的活性具有較強(qiáng)的抑制作用

4、，是關(guān)節(jié)軟骨中ADAMTS-4/5的天然抑制劑，調(diào)節(jié)其活性。因此，ADAMTS/TIMP-3系統(tǒng)平衡對(duì)OA的發(fā)展起著至關(guān)重要的作用。而將此系統(tǒng)作為藥物干預(yù)的靶點(diǎn)，從而觀察經(jīng)過(guò)干預(yù)后對(duì)疾病發(fā)展的作用，已經(jīng)成為新型抗OA藥物研制的策略。脫氫表雄酮(DHEA)是腎上腺皮質(zhì)網(wǎng)狀帶分泌的一種甾體類激素，它在血漿中的濃度隨著年齡的增長(zhǎng)而降低。近幾年，國(guó)外有學(xué)者開始從事DHEA離體實(shí)驗(yàn)和在體實(shí)驗(yàn)的研究，其研究結(jié)果提示DHEA對(duì)OA關(guān)節(jié)軟骨可能有保護(hù)作

5、用，然而具體機(jī)制尚不明確。本研究通過(guò)建立新西蘭大白兔膝OA模型，并研究關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射DHEA對(duì)退變關(guān)節(jié)軟骨的作用，并探討相關(guān)作用機(jī)制。
　　本次研究主要分成四部分:一、首先明確新西蘭大白兔OA模型隨疾病發(fā)展關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)學(xué)改變特征。二、脫氫表雄酮對(duì)兔中期及晚期OA的軟骨形態(tài)學(xué)改善作用。三、脫氫表雄酮對(duì)兔OA軟骨ADAMTS/TIMP-3酶系統(tǒng)的影響。我們的研究結(jié)果表明DHEA對(duì)OA關(guān)節(jié)軟骨具有保護(hù)作用，且這種保護(hù)作用具有時(shí)間依賴性和部

6、位特殊性，而其中的作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制軟骨中的侵襲因子ADAMTS-4和ADAMTS-5的分泌，促進(jìn)保護(hù)因子TIMP-3、TGF-β1的表達(dá)，阻止細(xì)胞外基質(zhì)主要成分Aggrecan及CollagenⅡ的降解來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本研究結(jié)果為臨床治療OA提供了一種新思路。
　　第一部分新西蘭大白兔OA模型建立及疾病發(fā)展特征
　　目的:
　　觀察前交叉韌帶離斷法(ACLT)建立新西蘭大白兔模型關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)學(xué)改變的特征。
　　方

7、法:
　　正常新西蘭大白兔采用3％戊巴比妥鈉靜脈麻醉，雙側(cè)膝關(guān)節(jié)常規(guī)消毒鋪巾后行ACLT，術(shù)后分籠不制動(dòng)飼養(yǎng)。分別在術(shù)后9周和16周麻醉處死后，迅速解剖雙側(cè)膝關(guān)節(jié)，將膝關(guān)節(jié)置于顯微外科用手術(shù)顯微鏡下肉眼進(jìn)行軟骨大體形態(tài)損傷評(píng)分。
　　結(jié)果:
　　在ACLT后9周，我們發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨表層不平整，表中層番紅染色減退，軟骨細(xì)胞排列不規(guī)則（相當(dāng)于中期OA的表現(xiàn)）。在ACLT后16周，軟骨全層破壞，部分標(biāo)本可見軟骨下骨外露以及關(guān)節(jié)

8、邊緣的巨大骨贅，軟骨細(xì)胞排列紊亂，軟骨全層番紅染色丟失（相當(dāng)于晚期OA的表現(xiàn)）。
　　結(jié)論:
　　ACLT術(shù)后，關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性退變，隨著飼養(yǎng)的時(shí)間增加，OA的病理改變也逐漸加重。
　　第二部分脫氫表雄酮對(duì)兔OA中期及晚期的軟骨形態(tài)學(xué)改善作用
　　目的:
　　明確關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射DHEA對(duì)中期及晚期OA關(guān)節(jié)軟骨的形態(tài)學(xué)改善作用，并明確這種形態(tài)學(xué)改善作用的特征。
　　方法:
　　30只成年雄性新西蘭大白

9、兔納入實(shí)驗(yàn)，其中20只行雙側(cè)膝ACLT造成關(guān)節(jié)不穩(wěn)建立動(dòng)物膝OA模型。術(shù)后4周，所有模型動(dòng)物左膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射100μmol/LDHEA(實(shí)驗(yàn)組)，右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射相同劑量的0.9％生理鹽水(NS)，每周1次。其中半數(shù)模型動(dòng)物于術(shù)后9周隨處死，剩下的動(dòng)物于術(shù)后16周處死并獲取雙側(cè)膝關(guān)節(jié)標(biāo)本。另外10只兔子作為對(duì)照，接受左膝關(guān)節(jié)假手術(shù)處理，并分別于術(shù)后9周及術(shù)后16周處死獲取標(biāo)本。所有膝關(guān)節(jié)標(biāo)本的股骨內(nèi)髁(MFC)、股骨外髁(LFC)、脛骨

10、內(nèi)坪(MTP)以及脛骨外坪(LTP)分別進(jìn)行大體評(píng)分及組織病理學(xué)Mankin評(píng)分。
　　結(jié)果:
　　假手術(shù)組膝關(guān)節(jié)軟骨股骨髁及脛骨坪軟骨未見明顯組織學(xué)破壞，軟骨表明光滑平整。所有進(jìn)行ACLT的膝關(guān)節(jié)軟骨呈現(xiàn)出不同程度的軟骨損害改變。與安慰劑組相比，DHEA關(guān)節(jié)腔內(nèi)給藥在術(shù)后9周顯著減輕了膝關(guān)節(jié)雙側(cè)間室的軟骨退行性改變。與安慰劑組相比，DHEA關(guān)節(jié)腔內(nèi)給藥在術(shù)后16周僅僅減輕了膝關(guān)節(jié)外側(cè)間室軟骨破壞，而對(duì)內(nèi)側(cè)間室軟骨無(wú)明顯改善

11、作用
　　結(jié)論:
　　DHEA對(duì)OA軟骨形態(tài)學(xué)改善作用具有時(shí)間依賴性和部位特殊性。DHEA對(duì)中期OA關(guān)節(jié)軟骨具有最為顯著的形態(tài)學(xué)改善作用。
　　第三部分脫氫表雄酮對(duì)兔骨關(guān)節(jié)炎軟骨ADAMTS/TIMP-3酶系的影響
　　目的:
　　觀察關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射脫氫表雄酮（DHEA）對(duì)兔骨關(guān)節(jié)炎(OA)模型ADAMTS/TIMP-3酶系統(tǒng)的影響，并探討其作用機(jī)制。
　　方法:
　　對(duì)經(jīng)過(guò)手術(shù)建模大白兔分為DH

12、EA干預(yù)組和安慰劑組，股骨內(nèi)髁軟骨組織行羥脯氨酸(Hyp)及糖胺聚糖(GAG)含量測(cè)定，用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨中蛋白聚糖酶-1（ADAMTS-4/aggrecanase-1）、蛋白聚糖酶-2（ADAMTS-5/aggrecanase-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-3(TIMP-3)、轉(zhuǎn)化因子-β1(TGF-β1)、蛋白聚糖(Aggrecan)、Ⅱ型膠原(CollagenⅡ)的表達(dá)，用免疫印跡(Weste

13、rn blot)法檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨中Ⅱ型膠原及蛋白聚糖裂解片段(AggrecanARGxx)的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　DHEA處理可以顯著上調(diào)Hyp和GAG含量，下調(diào)ADAMTS-4、ADAMTS-5的mRNA表達(dá)，上調(diào)TIMP-3、TGF-β1、Aggrecan、CollagenⅡ的mRNA表達(dá)，DHEA處理可以顯著抑制Aggrecan ARGxx的蛋白表達(dá)，并提高CollagenⅡ（2.28±0.69）蛋白表達(dá)。