獨(dú)一味對(duì)兔骨關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)軟骨影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討藏藥獨(dú)一味對(duì)兔KOA模型軟骨退變的保護(hù)或治療機(jī)制,為臨床獨(dú)一味防治骨關(guān)節(jié)炎的推廣應(yīng)用提供理論支持。
　　 方法：將40只新西蘭大白兔隨機(jī)編號(hào),分為五組,即,(A)空白對(duì)照組、(B)模型對(duì)照組、(C)小劑量組治療組、(D)中劑量組治療組、(E)大劑量組治療組,每組8只。A組作為空白對(duì)照組,行模擬手術(shù)。B、C、D、E組按Hulth方法,制造兔膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型。術(shù)后1周開始全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每天驅(qū)趕行走30 min,于造模1周后

2、開始灌胃,各治療組給藥劑量根據(jù)Meeh-Rubner公式計(jì)算,將按體表面積折算的臨床常用量等效劑量,溶于10mL蒸餾水中,獨(dú)一味小劑量治療組、中劑量治療組和大劑量治療組分別灌胃給予獨(dú)一味膠囊60mg/kg、120mg/kg、240mg/kg。每天灌胃給藥一次;空白對(duì)照組、模型對(duì)照組于同一時(shí)間點(diǎn)給予等量生理鹽水灌胃。治療6周,末次給藥后禁食12 h。處死動(dòng)物。再用組織學(xué)、免疫組化、RT-PCR學(xué)等技術(shù)對(duì)兔KOA模型關(guān)節(jié)軟骨、關(guān)節(jié)液等部位進(jìn)

3、行檢測和評(píng)估。
　　 切開實(shí)驗(yàn)側(cè)兔膝關(guān)節(jié),對(duì)兔膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨行大體觀察并參照文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分,比較各組間的差異;將關(guān)節(jié)軟骨制作成普通光學(xué)顯微鏡切片進(jìn)行觀察,并按照Mankin's關(guān)節(jié)軟骨組織學(xué)評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)分,比較各組間的差異;制作透射電子顯微鏡切片,觀察其超微病理變化。
　　 在切開膝關(guān)節(jié)之前抽取關(guān)節(jié)液,檢測關(guān)節(jié)液中IL-1β、NO的含量變化,比較各組間的差異;
　　 應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測藥物治療后,關(guān)節(jié)軟

4、骨MMP-3,MMP-13,TIMP-1mRNA表達(dá)的變化,比較各組間的差異;
　　 用免疫組化法分別測量關(guān)節(jié)軟骨組織GAG含量、Ⅱ型膠原陽性染色面積的變化,并比較各組間的差異:
　　 結(jié)果：給藥前后體重變化:與給藥前動(dòng)物體重相比較,各劑量治療組在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)體重均有不同程度的增加,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均為P＞0.05)。關(guān)節(jié)活動(dòng)度:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物關(guān)節(jié)被動(dòng)活動(dòng)度測定結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)6周時(shí),模型對(duì)照組與小劑量治療組相比,P＜0.05。各

5、治療組關(guān)節(jié)活動(dòng)度均有不同程度的恢復(fù),獨(dú)一味中劑量、大劑量治療組恢復(fù)程度尤為明顯(P＜0.01)。
　　 大體觀察,中、大劑量治療組與模型對(duì)照組比較,軟骨磨損、退變程度明顯減輕(P＜0.01),光鏡下觀察,治療組與模型對(duì)照組比較,Mankin's評(píng)分明顯降低,小劑量治療組與模型對(duì)照組比較,P＜0.05;中劑量、大劑量治療組與模型對(duì)照組比較,P＜0.01;電鏡觀察發(fā)現(xiàn),藥物治療后中、大劑量治療組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、排列等均優(yōu)于

6、模型對(duì)照組。
　　 經(jīng)不同劑量獨(dú)一味治療后,各組關(guān)節(jié)液中的NO、IL-1βD含量均值相對(duì)于模型對(duì)照組有所降低,各治療組間進(jìn)行比較,中、大劑量治療組關(guān)節(jié)液中NO、IL-1β含量與模型對(duì)照組比較明顯降低,比較有顯著性差異(P＜0.01)。小劑量治療組與模型對(duì)照組比較,經(jīng)檢驗(yàn),P＜0.05;提示隨著獨(dú)一味劑量的增大,關(guān)節(jié)液中NO、IL-1β含量進(jìn)一步降低。
　　 治療后,中、大劑量治療組與模型對(duì)照組比較,中、大劑量治療組MMP

7、-3,MMP-13的mRNA表達(dá)較低、而TIMP-1的mRNA表達(dá)較高;模型對(duì)照組關(guān)節(jié)軟骨中MMP-3,MMP-13的 mRNA表達(dá)明顯增高,而TIMP-1表達(dá)明顯降低。組間比較有顯著性差異(P＜0.01)。
　　 Ⅱ型膠原陽性染色后,模型對(duì)照組,陽性染色顯著減少,分布不均勻,且表淺層出現(xiàn)缺損;經(jīng)獨(dú)一味膠囊治療后,中、大劑量治療組與模型對(duì)照組比較,中、大劑量治療組Ⅱ型膠原陽性染色面積明顯增大,比較有顯著性差異(P＜0.01)。檢

8、測軟骨基質(zhì)中GAG含量,模型組與小劑量治療組比較,軟骨基質(zhì)中GAG含量有顯著性差異,P＜0.05;中劑量組治療組、高劑量組治療組與模型組分別比較,中、高劑量治療組軟骨基質(zhì)中GAG含量有顯著性差異,P＜0.01;
　　 結(jié)論：
　　 1.Hulth手術(shù)方法建立家兔膝OA模型,穩(wěn)定性好,成功率高,誘導(dǎo)周期較短,重復(fù)性好。
　　 2.獨(dú)一味通過減少兔膝OA模型關(guān)節(jié)液中NO、IL-1β含量,抑制MMPs表達(dá),增加TIMP

9、-1表達(dá),提高ECM中GAG含量,促進(jìn)Ⅱ型膠原的合成,延緩或一定程度上能夠阻止兔膝OA病變過程的發(fā)展,進(jìn)而改善兔膝OA關(guān)節(jié)功能。
　　 3.獨(dú)一味膠囊對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎的治療機(jī)制可能與這幾方面有關(guān):
　　 在兔膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型上,經(jīng)不同劑量獨(dú)一味治療后,能增加模型OA關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)活動(dòng)度,減輕或延緩軟骨退變、磨損程度和減少關(guān)節(jié)周圍軟骨性骨贅的增生,降低關(guān)節(jié)軟骨光鏡下的Mankin’s評(píng)分,中、高劑量治療組表現(xiàn)尤為明顯。

10、　　 應(yīng)用獨(dú)一味干預(yù)OA關(guān)節(jié)模型后,經(jīng)檢測關(guān)節(jié)液中的NO、IL-1β含量明顯降低,表明獨(dú)一味膠囊通過降低OA關(guān)節(jié)局部IL-1β、NO的水平,減輕關(guān)節(jié)滑液和滑膜的炎性反應(yīng),并呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。通過降低關(guān)節(jié)液中NO的含量,減少或延緩NO對(duì)關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的破壞作用,減少軟骨細(xì)胞的破壞,促進(jìn)軟骨細(xì)胞合成軟骨基質(zhì),抑制或減少軟骨細(xì)胞凋亡,使關(guān)節(jié)軟骨的破壞減少。通過降低關(guān)節(jié)液中IL-1β的含量,調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的合成代謝,抵抗強(qiáng)大的促炎癥作用,調(diào)

11、節(jié)關(guān)節(jié)軟骨分解代謝的影響;抑制或延緩骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)程。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,空白對(duì)照組MMP-3、MMP-13的mRNA表達(dá)低于模型對(duì)照組,而治療組中TIMP-1的mRNA表達(dá)高于模型對(duì)照組,進(jìn)一步驗(yàn)證了OA與基質(zhì)金屬蛋白酶、金屬蛋白酶抑制劑的調(diào)控密切相關(guān)。經(jīng)不同劑量獨(dú)一味治療后的各組MMP-3、MMP-13的mRNA表達(dá)均值均明顯少于模型對(duì)照組,提示獨(dú)一味能抑制MMP-3、MMP-13在關(guān)節(jié)軟骨組織中的表達(dá),并呈現(xiàn)出一定的劑量依賴