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文檔簡介
1、背景及目的:炎癥性腸?。↖nflammatory bowel disease,IBD),包括潰瘍性結腸炎(Ulcerativecolitis,UC)和克羅恩病(Crohn's disease,CD),是一種慢性腸道特發(fā)性疾病。大量研究表明遺傳、環(huán)境及免疫因素均與IBD相關。其中,免疫調節(jié)紊亂目前被認為是IBD發(fā)病的主要病因,但其發(fā)病機制仍未研究透徹。腸粘膜屏障(Intestinal mucosal barrier,IMB)包括機械屏障、
2、免疫屏障、生物屏障及化學屏障,是腸上皮抵抗外源物質的重要屏障。腸粘膜機械屏障由腸上皮細胞(Intestinal epithelial cell,IEC)及細胞之間的緊密連接(Tight junction,TJ)構成。其中,TJ起著重要的作用。研究表明,腸道炎癥與TJ之間有著密切的關系。IBD患者的腸道緊密連接嚴重破壞,腸道通透性明顯增加。另外,腸道緊密連接屏障的破壞會導致腸腔內有毒分子的滲透,誘導粘膜免疫系統(tǒng)和炎癥反應,引發(fā)腸道疾病甚至
3、全身系統(tǒng)性疾病如全身炎癥反應綜合征(Systemic inflammatoryresponse syndrome,SIRS)及多器官功能衰竭(Mutiply organ failure,MOF)。因此,目前認為有效的抑制炎癥及維持腸粘膜屏障功能是目前治療IBD的主要策略。
芳香烴受體(Aryl hydrocarbon receptor,AhR),是一種廣泛表達于機體各種細胞的轉錄因子。AhR通過與配體結合活化的方式入核,與Ah
4、R核轉錄子(AhR nucleartranslocator,ARNT)形成異源二聚體,特異性結合于AhR反應原件,誘導包括細胞色素酶4501A1(Cytochrome P4501A1,CYP1A1)等一系列下游基因的表達。6-甲?;胚岵3,2-B]咔(6-formylindolo(3,2-b) carbazole,F(xiàn)ICZ)是AhR的一種內源性配體,研究表明,F(xiàn)ICZ可以通過活化AhR參與細胞生理功能的維持,包括調控細胞增殖、凋亡,
5、抑制免疫反應等。
目前多項研究表明AhR活化可以抑制腸道炎癥,但是其具體機制仍不清楚。另一方面,我們實驗室的前期工作表明,AhR可以在腸梗阻模型中通過調節(jié)緊密連接蛋白的表達和定位緩解腸粘膜屏障功能異常。
因此,本課題通過模擬IBD動物模型及體外細胞模型,采用蛋白質免疫印跡(Westernblotting,WB)、實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Real-time quantitation PCR,Real-timeQ-P
6、CR)、免疫組化(Immunohistochemical,IHC)、免疫熒光(Immunofluorescence,IF)、跨膜電阻測量等技術,研究AhR活化減輕IBD腸道炎癥及緩解腸粘膜屏障功能異常的具體機制。
方法:
1.建立小鼠DSS誘導的結腸炎模型,通過給予小鼠FICZ腹腔注射處理,用小鼠體重改變、結腸長度、死亡率、結腸形態(tài)學改變及炎癥因子表達來評估小鼠腸道炎癥的炎性損害情況。采用Western blotti
7、ng、Real-time Q-PCR、IHC等技術檢測CYP1A1、(tristetraprolin) TTP、ZO-1、claudin-1、occludin等的表達變化。使用Ussing Chamber檢測小鼠結腸跨上皮電阻。觀察AhR活化對結腸炎炎癥及腸粘膜屏障功能的影響。
2.建立腸上皮細胞系LPS干預模型,通過給予FICZ處理、siRNA干擾AhR處理后,采用Western blotting、Real-time Q-P
8、CR、IF等技術檢測CYP1A1、TTP、MAPKAPK2、p-MAPKAPK2的表達,探討AhR活化緩解結腸炎炎癥的機制。
3.建立腸上皮細胞系TNF-α/IFN-γ干預模型,通過給予FICZ處理,用Westernblotting、Real-time Q-PCR、IF等技術檢測CYP1A1、ZO-1、claudin-1、occludin等的表達變化,并檢測細胞的跨上皮電阻(TER),探討AhR活化維持腸粘膜屏障功能的具體機制
9、。
結果:
1.小鼠DSS模型中,相比于Sham組,DSS處理組小鼠體重明顯降低,死亡率增加,結腸長度明顯縮短,腸粘膜正常形態(tài)學改變(表現(xiàn)為炎癥細胞浸潤、上皮細胞融合脫落等)。小鼠結腸跨上皮電阻下降,腸粘膜通透性增加,腸粘膜屏障功能受損。而給予小鼠AhR激動劑FICZ后,同DSS組相比較,小鼠體重有所回升,死亡率降低,結腸長度明顯增加,而腸粘膜損傷也有所緩解。小鼠結腸跨上皮電阻增加,腸粘膜屏障功能有所恢復。
10、 2.小鼠DSS模型中,給予FICZ可以顯著上調CYP1A1的表達,活化AhR。并且可以上調RNA結合蛋白TTP的表達。
3.體外LPS干預模型中,F(xiàn)ICZ可以顯著上調TTP表達。siRNA干擾AhR后,TTP表達有所下降,并且給予FICZ不能上調TTP的表達。另一方面,F(xiàn)ICZ可以抑制MK2的磷酸化。siRNA干擾AhR后,F(xiàn)ICZ不再能抑制MK2的磷酸化。
4.小鼠DSS模型中,DSS誘導的結腸炎結腸上皮中緊密連
11、接蛋白如ZO-1、claudin-1、occludin的表達有下降。而給予FICZ處理后可以顯著上調ZO-1、claudin-1、occludin的表達。
5.體外TNF-α/IFN-γ干預模型中,相比于TNF-α/IFN-γ處理組,給予FICZ可以上調細胞的跨上皮電阻,并且可以緩解ZO-1的結構破壞。另一方面,F(xiàn)ICZ可以增加MLC的磷酸化。
結論:
1.FICZ在體內體外模型中均可以活化AhR。
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