生長素相關(guān)基因調(diào)控桃果實(shí)成熟分子機(jī)制研究.pdf

1、桃果實(shí)根據(jù)質(zhì)地可分為溶質(zhì)型(Melting flesh，MF)、不溶質(zhì)型(Non-melting flesh，NMF)和硬質(zhì)型(Stony hard，SH)。YUCCA編碼類黃素單加氧酶(flavin monooxygenase-like)，催化吲哚丙酮酸生成生長素（IAA）。本研究為闡明YUCCA11基因在MF和SH肉質(zhì)類型桃果實(shí)差異表達(dá)的原因，對兩個(gè)品種YUCCA11基因啟動(dòng)子上游區(qū)域進(jìn)行分析;同時(shí)圍繞IAA在桃果實(shí)成熟過程中如何調(diào)

2、節(jié)PpACS1(ACC synthase1，ACS1)基因表達(dá)，對生長素/吲哚乙酸（Aux/IAA）基因家族進(jìn)行鑒定，結(jié)合轉(zhuǎn)基因番茄驗(yàn)證桃Aux/IAA基因功能，并構(gòu)建桃果實(shí)cDNA酵母文庫，篩選與ACS1基因啟動(dòng)子互作的生長素相關(guān)蛋白。研究結(jié)果如下:
　　1.YUCCA11啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)座子插入可能導(dǎo)致桃果實(shí)硬質(zhì)性狀
　　1)YUCCA11基因在MF型桃‘中油桃13號(CN13)’果實(shí)成熟期果肉中的表達(dá)隨著果實(shí)的成熟不斷上升，

3、其表達(dá)量也顯著高于在SH型桃‘中油桃16號(CN16)’中的表達(dá)量，而在兩個(gè)肉質(zhì)桃品種種子中表達(dá)差異不明顯;
　　2)參考桃基因組序列，在YUCCA11基因起始密碼子ATG上游啟動(dòng)子區(qū)域設(shè)計(jì)引物PF1和PR1進(jìn)行擴(kuò)增，與MF型桃相比，SH型桃YUCCA11基因ATG上游約2.1kb處有大片段的插入;NCBI blast發(fā)現(xiàn)插入片段為CACTA型轉(zhuǎn)座子，該轉(zhuǎn)座子標(biāo)記可明顯鑒別SH和非SH類型，表明轉(zhuǎn)座子的插入可能導(dǎo)致果實(shí)特異性元件失

4、去功能。
　　2.桃Aux/IAA基因家族鑒定及其功能分析
　　1)利用生物信息學(xué)鑒定桃基因組中Aux/IAA基因家族有22個(gè)成員，它們不均勻分布在5條染色體上。qRT-PCR分析10個(gè)Aux/IAA基因在MF型桃果實(shí)的表達(dá)量高于SH型桃果實(shí)表達(dá)，其中ppa011935m、ppa020369m、ppa010303m和ppa010871m尤為顯著，暗示它們可能參與調(diào)控桃果實(shí)的成熟軟化。
　　2)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將PpIA

5、A19(ppa011935m)基因?qū)隡icro-Tom番茄中，獲得了轉(zhuǎn)基因陽性植株。與野生型番茄相比，PpIAA19轉(zhuǎn)基因改變了番茄的生長特性，影響了番茄的節(jié)間長度，株高增加;側(cè)根數(shù)目減少;果形改變，形成果尖，同時(shí)果實(shí)種子數(shù)減少，并可引起單性結(jié)實(shí)。
　　3.桃果實(shí)酵母cDNA文庫構(gòu)建與PpACS1啟動(dòng)子文庫篩選
　　1)采用SMART和DSN技術(shù)，構(gòu)建了桃果實(shí)均一化cDNA酵母表達(dá)文庫。文庫庫容3.2×106，文庫滴度3.

6、5×107，重組率達(dá)到83.33％，并具有較好的完整性，表明該均一化文庫的質(zhì)量比較高。該文庫可以成功用于酵母雜交試驗(yàn)，為研究桃果實(shí)篩選DNA與蛋白、蛋白與蛋白之間的互作提供了有效的工具;
　　2)以PpACS1基因啟動(dòng)子1784bp序列為餌篩選酵母文庫，去除重復(fù)序列后獲得33個(gè)單一序列，經(jīng)過BLAST比對和Phytozome注釋結(jié)果顯示，互作蛋白主要包括核糖體蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、細(xì)胞色素相關(guān)蛋白和激素誘導(dǎo)蛋白等，其中有2個(gè)與生長素相關(guān)