宏基因組學(xué)方法在環(huán)境微生物生態(tài)及基因查找中的應(yīng)用研究.pdf

1、宏基因組學(xué)是一種對直接來自于環(huán)境樣品中的微生物群體基因組進(jìn)行研究的新的微生物研究領(lǐng)域。本論文基于宏基因組學(xué)研究方法在環(huán)境微生物研究中的眾多優(yōu)勢，擬應(yīng)用這一近年新興的研究方法對家蠶腸道中細(xì)菌種群構(gòu)成進(jìn)行調(diào)查分析，及對水環(huán)境微生物中的整合子-基因盒的分布、信息編碼情況及其在環(huán)境微生物基因組進(jìn)化中作用作一個初步的研究探討。 一、近年來快速發(fā)展的分子生物學(xué)研究證實，在多數(shù)的生態(tài)環(huán)境中可培養(yǎng)的微生物只占生態(tài)系統(tǒng)中微生物總數(shù)量的一小部分。因

2、此，通過傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法獲得的特定環(huán)境中微生物的群落結(jié)構(gòu)信息顯然是很不全面的。為了更加全面地了解家蠶腸道內(nèi)微生物的群落結(jié)構(gòu)及它們的生理功能，我們采用了宏基因組學(xué)的方法和傳統(tǒng)培養(yǎng)法相結(jié)合來進(jìn)行研究。宏基因組的方法是：繞過培養(yǎng)障礙，用SDS-高鹽法和SDS-高鹽-凍融法直接提取家蠶腸道微生物的總DNA(即宏基因組DNA)，擴增并建立細(xì)菌16SrDNA基因文庫，再用RFLP分析技術(shù)對文庫進(jìn)行篩選，對所獲得的序列進(jìn)行測序，比對分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

3、；同時對這些細(xì)菌在家蠶腸道內(nèi)所起的作用進(jìn)行探討。 兩種四堿基限制性內(nèi)切酶MspⅠ、HaeⅢ酶切分析16SrDNA基因文庫后，從205個陽性克隆中存在發(fā)現(xiàn)有16種不同的酶切譜型。其中MspⅠ消化后有11種差異譜型，HaeⅢ消化后有5種差異譜型。從所獲得的16種酶切譜型中選擇出代表性克隆進(jìn)行測序，并將序列提交美國國家生物信息中心(NCBI)進(jìn)行同源性比對。分析顯示，16條序列中有7條與6個已知的細(xì)菌屬具有同源性，分別是節(jié)桿菌屬(Ar

4、throbacter)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、大腸桿菌屬(Escherichia)、芽胞桿菌屬(Bacillus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)和假單胞菌屬(Pseudomonas)。另外9條序列與一些未知細(xì)菌的16SrRNA基因具有較高的同源性。系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，SWM22的來源菌可能與家蠶體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)及能量的轉(zhuǎn)化有關(guān)；SWM90、SWM99、SWM8、SWM35、SWM145的來源菌可能使家蠶致??；

5、SWM94的來源菌可能能夠促進(jìn)家蠶營養(yǎng)的轉(zhuǎn)化與吸收。SWM2、SWM19、SWM34、SWM35、SWM42、SWM62、SWM86、SWM94、SWM98、SWM141因只與一些未知細(xì)菌具有同源性，因此它們的來源菌與宿主家蠶的關(guān)系我們也不得而知。 另外，采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)法，我們獲得了葡萄球菌屬、芽胞桿菌屬、乳桿菌屬、節(jié)桿菌屬、埃希氏菌屬共5個屬6個種的細(xì)菌，其序列與未培養(yǎng)法獲得序列中的6條具有很高的同源性。結(jié)合非培養(yǎng)法研究所得到

6、的結(jié)果。比較分析了培養(yǎng)法和非培養(yǎng)法在環(huán)境微生物生態(tài)學(xué)研究中的優(yōu)劣。認(rèn)為，非培養(yǎng)法和培養(yǎng)法均有各自的優(yōu)點和不足，兩者具有較強的互補性。 二、整合子是一個能夠通過自身編碼的整合酶來獲取胞外游離基因或基因片段并使之表達(dá)的遺傳元件系統(tǒng)。整合子所捕獲的DNA單元—基因盒，是迄今為止已知的最簡單的移動元件。本研究以根據(jù)基因盒中每個基因兩側(cè)的59-堿基元件(59-baseelement，59-be)保守序列設(shè)計的引物HS286-HS287作為

7、擴增引物，以PCR的方法從環(huán)境微生物的宏基因組DNA中擴增基因盒，期望能夠發(fā)現(xiàn)一些新的關(guān)于整合子-基因盒系統(tǒng)的有用信息。 從采集的水樣品中提取到環(huán)境微生物宏基因組DNA，以HS286-HS287為引物擴增到了特異性條帶，大小在300-2000bp之間。將PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性克隆，測定其插入片段的核苷酸序列。信息學(xué)分析表明，我們共得到7個不同的整合子-基因盒，含有13個可能

8、的ORF。把推導(dǎo)的氨基酸序列通過BlastP比對發(fā)現(xiàn)后，發(fā)現(xiàn)這些ORF與數(shù)據(jù)庫中的一些蛋白質(zhì)的序列有較高的同源性，其中5個序列為變形細(xì)菌的假設(shè)蛋白；一個為真菌的假設(shè)蛋白；一個為同樣來自于整合子-基因盒研究的假設(shè)蛋白序列。另外6個推導(dǎo)蛋白分別與變形細(xì)菌的功能蛋白木酮糖激酶、ComEC/Rec2類蛋白、β-內(nèi)酰胺酶、DNA修復(fù)蛋白RecN、Na/Pi共轉(zhuǎn)運體蛋白及放線菌假諾卡氏屬菌的Tuf1具有較高的相似性。其中orf9-19＃、orf10

9、-20＃分別與來自于α-變形細(xì)菌苜蓿中華根瘤菌的β-內(nèi)酰胺酶、γ-變形細(xì)菌一個未培養(yǎng)的假單胞菌屬的DNA修復(fù)蛋白RecN具有很高的相似性。我們重點分析了19＃和20?；蚝?。 19＃的序列全長1800bp,正反向各有兩個ORF。其中orf9-19＃位于19＃基因盒反向序列的531-1718位，共編碼396個氨基酸。對其氨基酸序列進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)orf9_19＃中含有C類β-內(nèi)酰胺酶特有的三個高度保守序列，它們分別是S94VSK、Y

10、180SN、K343TG。對A、B、C、D四類β-內(nèi)酰胺酶的氨基酸序列進(jìn)行聚類分析后表明orf9_19＃與C類β-內(nèi)酰胺酶處于同一進(jìn)化枝上。故我們可以確定orf9_19＃為C類β-內(nèi)酰胺酶。 在20?；蚝行蛄兄?，我們預(yù)測到一個編碼DNA修復(fù)蛋白RecN的基因orf10_20＃。根據(jù)RecN蛋白的功能特異性及前人對DNA修復(fù)系統(tǒng)的進(jìn)化研究結(jié)果使我們有理由相信在本次整合子-基因盒系統(tǒng)研究中所得到的與RecN相似的基因與微生物或其它