Asia1型FMDV復(fù)合表位免疫原的研制及免疫效果研究.pdf

1、口蹄疫(Foot-and-mouth Disease，F(xiàn)MD)作為一種全球范圍內(nèi)的重大動(dòng)物疫病，已成為當(dāng)前動(dòng)物及其產(chǎn)品國際貿(mào)易的主要障礙。O、A、Asia1型FMD是我國一直以來的防治重點(diǎn)，滅活疫苗在預(yù)防和控制FMD的過程中發(fā)揮著重要作用。
　　 機(jī)體抵抗口蹄疫病毒(Foot-and-mouth Disease Virus，F(xiàn)MDV)感染過程中，依賴于中和抗體的體液免疫反應(yīng)是最主要的。雖然滅活疫苗免疫能夠產(chǎn)生高水平的中和抗體，但

2、高水平的中和抗體并不是總能為機(jī)體提供完全的保護(hù)，同時(shí)CD4+T細(xì)胞在誘導(dǎo)機(jī)體體液抗體水平方面發(fā)揮著重要的作用，提示同時(shí)提高機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫對(duì)于FMD的預(yù)防更有意義。復(fù)合表位疫苗減少了疫苗中與免疫無關(guān)的成分，同時(shí)可對(duì)T、B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行不同組合，是實(shí)現(xiàn)口蹄疫體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答的理想選擇。FMDV主要是依靠接觸和空氣進(jìn)行傳播，黏膜免疫應(yīng)答能夠在黏膜部位產(chǎn)生大量的分泌性的sIgA，分泌性的sIgA不僅可以在第一時(shí)間中和病毒，

3、而且可通過黏膜的方式進(jìn)一步激活系統(tǒng)免疫反應(yīng)，進(jìn)而阻止病毒的侵入。所以有效的誘導(dǎo)黏膜部位產(chǎn)生sIgA是口蹄疫疫苗發(fā)展的新方向。
　　 本研究人工設(shè)計(jì)了復(fù)合表位肽，并分別以乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)和牛IgG2a Fc片段為載體，利用原核表達(dá)系統(tǒng)和畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，制備三種復(fù)合表位免疫原pET28a-HBc-EB、pET22b-EB-BIg和rGS115-pPICZA-HBc-EB，通過腹腔注射、口服和滴鼻三種途徑分別對(duì)小鼠

4、進(jìn)行免疫，從體液免疫、細(xì)胞免疫和黏膜免疫水平對(duì)復(fù)合表位疫苗的免疫效果進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。
　　 (1) Asia1型FMDV復(fù)合表位免疫原的設(shè)計(jì)及合成
　　 選取VP1上第140～160位、第200～211位兩個(gè)B細(xì)胞表位和VP1上第20～40位、3A上第21～35兩個(gè)T細(xì)胞表位為候選表位，并在其間引入合適的linker序列，構(gòu)成了Asia1型FMDV的復(fù)合表位。該復(fù)合表位肽通過linker序列GSGSG融合于HBcAg的第7

5、8～79位氨基酸（刺突位置），軟件分析表明，Linker序列在表位之間形成柔性區(qū)域和轉(zhuǎn)角，特別是序列(G4S)3的引入保證了兩個(gè)B細(xì)胞表位的獨(dú)立作用，而復(fù)合表位肽所在的HBc刺突位置具有較高的抗原性且大部分存在于表位部分，并有出現(xiàn)在分子表面的可能性，將融合有復(fù)合表位的HBc Ag序列優(yōu)化后合成。
　　 (2)復(fù)合表位免疫原在原核表達(dá)系統(tǒng)中的制備及腹腔免疫效果評(píng)價(jià)
　　 1)復(fù)合表位免疫原在原核表達(dá)系統(tǒng)中的制備
　　

6、 以合成的質(zhì)粒pUC57-simple-HBc-EB為模板，PCR擴(kuò)增出目的基因，產(chǎn)物酶切后與pET28a連接，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-HBc-EB。以合成的含有牛IgG2a Fc片段基因的pUC57-simple-BIg質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增出牛IgG2a Fc片段基因，并利用融合PCR方法與復(fù)合表位基因連接，酶切后與pET22b連接，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET22b-EB-BIg。復(fù)性后的重組pET28a-HBc-EB在電鏡下可觀察到

7、病毒樣粒子的存在，而重組蛋白pET22b-EB-BIg也形成了類似免疫球蛋白單體的形式，能夠與兔抗牛抗體直接結(jié)合。Western blot鑒定結(jié)果表明兩免疫原均具備良好的抗原性，更為重要的是Dot ELISA結(jié)果顯示復(fù)性后的復(fù)合表位免疫原能夠與Asia1型FMDV VPI構(gòu)象表位抗體很好的結(jié)合，間接說明復(fù)合后的表位免疫原能夠一定程度上折疊為類似于Asia1型VP1蛋白構(gòu)象型表位的抗原結(jié)構(gòu)。
　　 2)復(fù)合表位免疫原腹腔免疫效果評(píng)

8、價(jià)
　　 免疫后28d的檢測(cè)結(jié)果表明，pET28a-HBc-EB組和pET22b-EB-BIg組小鼠抗體水平顯著高于疫苗免疫組(P＜0.01或P＜0.05)，pET28a-HBc-EB組的抗體水平顯著高于pET22b-EB-BIg組(P＜0.05);pET28a-HBc-EB組液相阻斷抗體效價(jià)高于疫苗免疫組，為1∶256～1∶512;而pET22b-EB-BIg組液相阻斷抗體效價(jià)為1∶128～1∶256，與滅活疫苗組相當(dāng);pET

9、28a-HBc-EB組和pET22b-EB-BIg組的淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)顯著高于滅活疫苗免疫組(P＜0.01)。pET28a-HBc-EB組和pET22b-EB-BIg組的CD4+/CD8+比值顯著高于滅活疫苗組(P＜0.01，P＜0.05)。pET28a-HBc-EB組和pET22b-EB-BIg組小鼠脾細(xì)胞刺激后產(chǎn)生的IL-2和IFN-γ顯著高于滅活疫苗組(P＜0.01)，pET28a-HBc-EB組IL-4和IL-10產(chǎn)生水平顯著高

10、于滅活疫苗組(P＜0.05)，而pET22b-EB-BIg組與滅活疫苗組無顯著差異。表明Asia1型FMDV多表位免疫原具有良好的免疫效果，既可刺激機(jī)體產(chǎn)生高水平的體液免疫，又可以刺激機(jī)體發(fā)生細(xì)胞免疫，其中以pET28a-HBc-EB組免疫效果最佳。
　　 復(fù)合表位免疫原腹腔免疫較為理想的效果證實(shí)了復(fù)合表位免疫原的有效性，為口服免疫和滴鼻免疫提供了保證。
　　 (3)復(fù)合表位免疫原在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中的制備及口服免疫效果

11、評(píng)價(jià)
　　 1)復(fù)合表位免疫原在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中的制備
　　 本研究鑒于畢赤酵母具備真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的修飾功能的特點(diǎn)，以期獲得具有天然結(jié)構(gòu)的復(fù)合表位免疫原。酶切重組質(zhì)粒pET28a-HBc-EB，獲得復(fù)合表位多肽基因，與pPICZA胞內(nèi)表達(dá)載體連接，獲得重組質(zhì)粒pPICZA-HBc-EB;以本實(shí)驗(yàn)保存的含有Asia1型FMDV全基因的質(zhì)粒為模板，分別擴(kuò)增病毒衣殼蛋白編碼基因，并分別克隆于畢赤酵母表達(dá)載體pPICZA中，

12、然后通過PCR方法在含有各表達(dá)盒兩端引入酶切位點(diǎn)，各表達(dá)盒經(jīng)酶切后依次將連入pPICZA載體中，最終構(gòu)建酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZA-vp031;Western blot和Dot ELISA鑒定結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物具有良好的抗原性。
　　 2)重組畢赤酵母以5×108CFU劑量口服免疫小鼠，免疫后28d檢測(cè)結(jié)果表明，pPICZA-HBc-EB組和pPICZA-vp031組抗體水平顯著低于滅活疫苗免疫組(P＜0.01);液相阻斷抗體效價(jià)為

13、1∶8～1∶16;畢赤酵母免疫組小鼠黏膜沖洗液sIgA和特異性sIgA總量顯著高于疫苗組(P＜0.01); pPICZA-HBc-EB組和pPICZA-vp031組的黏膜特異性sIgA顯著高于滅活疫苗組(P＜0.01);pPICZA-HBc-EB組和pPICZA-vp031組淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)均顯著高于滅活疫苗免疫組(P＜0.01)，而pPICZA-HBc-EB組顯著高于pPICZA-vp031組(P＜0.05);滅活疫苗組CD4+/CD

14、8+比值顯著高于pPICZA-HBc-EB組和pPICZA-vp031組(P＜0.01); pPICZA-HBc-EB組小鼠脾細(xì)胞刺激后產(chǎn)生的IL-2和IFN-γ顯著高于滅活疫苗組(P＜0.01)，而pPICZA-vp031組則與滅活疫苗組無顯著差異(P＞0.05)，pPICZA-HBc-EB組和pPICZA-vp031組IL-4和IL-10水平與滅活疫苗組無顯著差異(P＞0.05).說明口服重組酵母菌不僅可刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免

15、疫，而且還能顯著地誘導(dǎo)機(jī)體黏膜免疫。證實(shí)了復(fù)合表位免疫原通過口服免疫激發(fā)黏膜免疫的可行性。
　　 (4)復(fù)合表位免疫原滴鼻免疫效果的評(píng)價(jià)
　　 利用原核系統(tǒng)制備的復(fù)合表位疫苗對(duì)小鼠進(jìn)行滴鼻免疫，免疫后28d pET22b-EB-BIg組抗體水平顯著高于pET28a-HBc-EB組(P＜0.01)，顯著低于滅活疫苗免疫組(P＜0.01)，且抗體上升趨勢(shì)較為緩慢;液相阻斷抗體效價(jià)低于1∶8; pET22b-EB-BIg滴鼻免

16、疫組黏膜沖洗液總sIgA水平、黏膜特異性sIgA抗體水平顯著高于滅活疫苗組、pET28a-HBc-EB滴鼻免疫組(P＜0.01);pET22b-EB-BIg滴鼻免疫組的刺激指數(shù)顯著高于其他各組(P＜0.05);pET22b-EB-BIg滴鼻免疫組CD4+/CD8+比值顯著低于滅活疫苗免疫組(P＜0.01)。上述結(jié)果說明pET22b-EB-BIg免疫后小鼠上支氣管和肺部沖洗液、腸沖洗液和生殖道沖洗液中均有特異性sIgA的分泌，同時(shí)機(jī)體產(chǎn)生