HIV-1 AE重組型包膜蛋白疫苗構(gòu)建及免疫原改造和免疫策略研究.pdf

1、人免疫缺陷病毒Ⅰ型（Human Immunodeficiency Virus Type I，HIV-1）感染可以導致獲得性免疫缺陷綜合癥（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS），即艾滋病。艾滋病已成為有史以來最具破壞性的傳染病之一：目前全球共存活艾滋病病毒感染者和病人（HIV/AIDS）約3340萬人（約占總?cè)丝诘?.6％），在中國這個數(shù)字也有是74萬，且2009年當年中國新發(fā)艾滋病病毒感染者就

2、有4.8萬人。HIV-1一旦感染，便很難被機體清除；結(jié)合歷史上多次傳染病控制經(jīng)驗，研發(fā)有效安全的疫苗將是控制HIV-1大規(guī)模流行的最佳途徑。流行病學調(diào)查顯示我國HIV-1最主要的流行亞型或流行重組型是CRF07 BC，CRF08 BC，B’（泰國B）和CRf01_AE。其中AE重組型病毒主要通過性接觸途徑傳播，而性接觸是已成為我國新發(fā)感染的主要途徑，伴隨這一情況，AE重組型在新發(fā)感染中的比例也呈逐年上升的態(tài)勢。因此研發(fā)針對HIV-1 A

3、E重組型的預防性疫苗，對于控制我國HIV-1的傳播有重要意義。
　　 包膜蛋白是設計HV-1抗體疫苗時選擇的主要免疫原。但是，天然的HIV-1包膜蛋白由于高度糖基化導致一些保守抗原表位遮蔽，因而天然HIV-1膜蛋白難于有效地活化廣譜中和抗體。有研究顯示，通過對包膜蛋白糖基化位點的修飾改造可以消除這些不利因素，提高HIV-1膜蛋白活化中和抗體的能力。所以在本研究的第一部分，我們構(gòu)建了表達HIV-1 AE重組型膜蛋白gp140的DN

4、A疫苗，并在此基礎上通過定點突變方法分別突變了gp140 V1/V3的157/161和V4區(qū)的382/388糖基化位點，并構(gòu)建成相應DNA疫苗m157/161和m157/161。Western Blot結(jié)果顯示，改造前后的質(zhì)粒均可以高效表達目的蛋白，其中包括大量以分泌形式存在的蛋白；改造對蛋白的表達量無明顯影響。
　　 為了評價上述幾種DNA疫苗活化的免疫反應特征，我們用所構(gòu)建的DNA疫苗肌肉注射免疫小鼠4次，最后一次免疫兩周后

5、處死小鼠進行檢測。基于IFN-γ檢測的ELISPOT實驗顯示，gp140免疫組小鼠的特異性T細胞反應為（2432±586）SFCs/106脾細胞，m157/161組為（2682±893）SFCs/106脾細胞，m382/388組為（2360±560）SFCs/106脾細胞，各實驗組間無統(tǒng)計學差異。說明疫苗可以活化高水平T細胞反應，且糖基化改造對疫苗活化的特異性T細胞反應強度沒有顯著影響。EIASA實驗檢測小鼠血清中的結(jié)合抗體，結(jié)果顯示，

6、gp140組平均抗體滴度是4800，m157/161組是1600，m382/388組是1200。兩個糖基化改造組顯著低于未改造組，p<0.02。說明糖基化位點突變后，膜蛋白疫苗活化結(jié)合抗體反應的能力明顯下降。
　　 最后，用體外中和實驗評價小鼠血清對3株B'/C重組型HIV-1臨床分離株（XBC6371，XBC0793和XBC6431）的中和能力。數(shù)據(jù)顯示：對XBC6371和XBC6431病毒株，gp140免疫組的血清幾乎沒有中

7、和作用，m157/161和m382/388組有個別小鼠出現(xiàn)6％～16％的中和活性；中和XBC0793病毒時，m157/161組平均病毒抑制率為47％，顯著高于gp140免疫組（17.7％），p=0.023；m382/388平均病毒抑制率為49％，也顯著高于gp140免疫組，p=0.013。說明157/161和382/388位點的糖基化改造可以提高HIV-1AE亞型gp140疫苗中和異源型別病毒能力，并且中和活性的提高并不是因為結(jié)合抗體的

8、活化導致的。這部分實驗結(jié)果說明，本實驗構(gòu)建了可以有效活化結(jié)合抗體和T細胞反應的AE亞型膜蛋白疫苗；本實驗開發(fā)的糖基化位點改造方案為增強HIV膜蛋白疫苗活化中和抗體能力提供了一定思路。后續(xù)應選擇更多不同來源病毒株對其中和能力進行進一步驗證，其中和能力提高的原因也需要進行進一步研究。
　　 另一方面，合適的載體是提高疫苗效果的有效途徑之一。經(jīng)過多年臨床使用的、安全性好的復制型痘苗病毒載體疫苗將是艾滋病載體疫苗未來發(fā)展的主流方向之一。

9、相對于DNA疫苗或痘病毒疫苗單獨免疫，DNA初免.痘病毒加強策略可以提高免疫原的免疫原性，并且避免了加強針對載體的免疫反應。因而本研究第二部分中，我們構(gòu)建了表達HIV-1 AE亞型包膜蛋白的復制型天壇株痘苗病毒載體疫苗，并使用DNA疫苗初免/痘苗病毒加強策略，在小鼠模型評價疫苗的免疫效果。以往研究發(fā)現(xiàn)，包膜蛋白去除胞內(nèi)區(qū)和跨膜區(qū)的截短型gp140作為可分泌抗原，可以活化高水平的抗體反應；而保留跨膜區(qū)，僅去除胞內(nèi)區(qū)的另一種截短型包膜蛋白g

10、p145被證明相對gp140可以更好的活化T細胞反應。我們設想，在DNA初免/痘苗病毒加強策略下，用gp140和gp145先后免疫同一個體是否可以同時活化高水平的T細胞反應和抗體反應?于是在第二部分研究中，我們設計了gp140和gp145疫苗異源交叉初免/加強的實驗方案，即用一種截短型膜蛋白DNA免疫3次后，用另一種截短型膜蛋白重組痘苗病毒加強免疫1次，以探討不同免疫方案活化的免疫效果，并選擇最優(yōu)方案。
　　 我們首先用ELIS

11、A實驗方法檢測了疫苗活化的結(jié)合抗體，結(jié)果顯示gp140DNA-gp140痘苗免疫組和gp140DNA-gp145痘苗免疫組活化了很高的抗體反應，滴度的幾何平均值分別為12800和19401；而gp145 DNA-gp145痘苗免疫組和gp145DNA-gp140痘苗免疫組活化的結(jié)合抗體滴度的幾何平均值分別只有566和606。本結(jié)果證實了gp140初免活化抗體的能力高于gp145初免；同時發(fā)現(xiàn)在本免疫策略下，初免選擇的DNA免疫原類型主要

12、決定了小鼠最終的抗體滴度。接著我們用基于IFN-γ檢測的ELISPOT實驗方法評價了各實驗組活化的特異性T細胞反應水平。結(jié)果顯示，gp145疫苗初免加強組活化的T細胞反應（（3424±650）SFCs/106脾細胞），高于gp140疫苗初免/加強組（（1918±442）SFCs/106脾細胞）。并且，gp140 DNA初免的小鼠，用gp145痘苗異源加強可以活化比用gp140加強更高一些的T細胞反應；同樣，用gp145 DNA初免的小鼠

13、，用gp145加強也比用gp140加強活化的T細胞反應略高。這部分數(shù)據(jù)說明，相對于gp140，gp145無論用做初免還是加強，都可以更好的活化T細胞反應。結(jié)合以上兩部分數(shù)據(jù)可以看出，gp140 DNA初免/gp145痘苗病毒加強是可以同時活化高水平的T細胞反應和結(jié)合抗體反應的免疫方案。
　　 為了深入了解該疫苗活化的T細胞反應特征，本部分進一步研究了AE亞型膜蛋白疫苗在BALB/c（H-2d）小鼠模型上的T細胞表位分布，用肽庫作

14、圖篩選法，我們定位到幾個可以活化相對較強T細胞反應的肽表位：35號肽（NSNNTTNGPNKIGNI）、16號肽（ETEVHNVWATHACVP）、136號肽（QQQSNLLRAIEAQQH）和106號肽（GQAMYAPPISGRINC）。其中，第35號肽是一個很強的T細胞免疫優(yōu)勢表位，針對這個表位的T細胞反應強度占到總T細胞反應的61.3％。針對以上幾個肽表位的T細胞反應占總T細胞反應的81.7％，說明本疫苗在BALB/c小鼠體內(nèi)活化

15、的T細胞免疫反應主要集中于幾個優(yōu)勢表位上。經(jīng)過與Los Alamos HIV數(shù)據(jù)庫和其他研究文章的比對，我們發(fā)現(xiàn)本實驗定位到的35號肽表位為本實驗首次發(fā)現(xiàn)到的H-2d限制性T細胞表位。該研究將為評價HIV疫苗在H-2d型遺傳背景下的免疫效果提供數(shù)據(jù)支持。本研究也存在一定的局限之處，期待對本研究的疫苗和免疫策略在非人靈長類大動物模型的進一步評價及對其活化中和抗體能力的進一步評價；也提示了開發(fā)可以活化針對更多表位，尤其是保守表位的T細胞反應