創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白免疫原性及其免疫刺激復(fù)合物對(duì)鰻鱺免疫效果的研究.pdf

1、創(chuàng)傷弧菌(Vbrio Vulnificus) FJO3-X2菌株為本研究室分離、鑒定、保種，屬于創(chuàng)傷弧菌I型菌株，是歐洲鰻鱺(Anguilla anguilla)的致病菌。該菌株具溶血活性和酪蛋白酶活性，對(duì)歐鰻幼鰻(約30克/尾)的半數(shù)致死劑量( LD50)約為7.1×103CFU/尾，并已利用16S rDNA序列比較分析及創(chuàng)傷弧菌溶血素特異性Nested-PCR進(jìn)行了聯(lián)合鑒定。 首先本研究分別采用不同的方法分離創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白

2、(outer membraneproteins，OMP)，比較了各種方法的提取效果，篩選最佳的創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白提取方法。制備了兔抗創(chuàng)傷弧菌FJ03-X2全菌血清，并應(yīng)用SDS-PAGE和Western-blotting分析比較了兩種方法提取的外膜蛋白的組分和抗原性。SDS-PAGE結(jié)果表明，Sarkosyl法分離的主要外膜蛋白相對(duì)分子量集中在66～14kDa之間；相對(duì)分子量為38kDa、36kDa的外膜蛋白為高豐度蛋白。用兔抗全菌高免血

3、清進(jìn)行的Western-blotting結(jié)果顯示，抗血清能識(shí)別絕大多數(shù)外膜蛋白組分，說(shuō)明FJ03-X2菌株的外膜蛋白具有良好的抗原性。其中相對(duì)分子量分別為66kDa、47kDa、44kDa、38kDa、36kDa、34kDa的外膜蛋白呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，是主要的免疫原組分。同時(shí)對(duì)創(chuàng)傷弧菌在不同培養(yǎng)條件下的外膜蛋白產(chǎn)量進(jìn)行了比較分析，結(jié)果說(shuō)明創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白產(chǎn)量與溫度和時(shí)間存在直接相關(guān)性。 其次本研究制備出創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白(OMP)免疫

4、刺激復(fù)合物(ISCOMs)亞單位疫苗，腹腔注射免疫歐鰻，間接ELISA法測(cè)得免疫后第7d、14d、21d、28d、35d、42d所采集的血清抗體效價(jià)分別為1：100、1：3200、1：6400、1：12800、1：3200、1：1600，歐鰻的血清抗體應(yīng)答水平先呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，免疫后第28d達(dá)到峰值，之后開(kāi)始下降；但是在第42d仍能檢測(cè)到相應(yīng)抗體。同時(shí)在第28d用創(chuàng)傷弧菌進(jìn)行攻毒，OMP-ISCOMs免疫組的免疫保護(hù)力可達(dá)到100％;而O

5、MPs免疫組的免疫保護(hù)力為70％;對(duì)照組全部死亡；說(shuō)明OMP-ISCOMs具有很強(qiáng)的免疫原性，能誘導(dǎo)歐鰻產(chǎn)生較高的免疫保護(hù)性。這與第28d歐鰻血清抗體水平最高也是一致的。免疫印跡結(jié)果顯示，在印跡膜上對(duì)應(yīng)的位置可檢測(cè)到OMP的4條主要蛋白條帶且免疫反應(yīng)性強(qiáng)，其相對(duì)分子量分別為47kDa、38kDa、36kDa、34kDa。上述試驗(yàn)結(jié)果提示，創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白是重要的保護(hù)性抗原，在制備成ISCOMs亞單位疫苗的情況下，較小的劑量單次免疫即可起

6、到顯著的免疫保護(hù)效果。 第三為了進(jìn)一步探討不同弧菌間是否存在具有共同特性的外膜蛋白，我們對(duì)Sarkosyl法分離的創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)的外膜蛋白(OMP)進(jìn)行了初步的比較分析。這4種弧菌外膜蛋白的SDS-PAGE和Western blotti

7、ng的圖譜有相似性亦有差異。SDS-PAGE顯示，四種弧菌中除副溶血弧菌外都能分離到47kDa、38kDa的外膜蛋白；創(chuàng)傷弧菌和溶藻弧菌存在4種共同的外膜蛋白，相對(duì)分子量為47kDa、40kDa、38kDa、36kDa;溶藻弧菌和鰻弧菌有75kDa、47kDa、43kDa、38kDa的4種共同的外膜蛋白。制備了兔抗創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白高免血清，間接ELISA測(cè)定血清效價(jià)為1:51200。用該抗血清進(jìn)行免疫印跡的結(jié)果顯示，兔抗創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白

8、血清能與創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白、溶藻弧菌外膜蛋白、鰻弧菌外膜蛋白進(jìn)行免疫反應(yīng)，其中與溶藻弧菌外膜蛋白的反應(yīng)性相對(duì)較強(qiáng)，有三條清晰的反應(yīng)發(fā)色帶，相對(duì)分子量為38kDa、30kDa、29kDa;同時(shí)抗血清與嗜水氣單胞菌外膜蛋白無(wú)反應(yīng)帶；而38kDa的外膜蛋白是創(chuàng)傷弧菌和溶藻弧菌共同的免疫反應(yīng)帶；說(shuō)明這兩種弧菌可能有共同的保護(hù)性抗原。 本研究對(duì)創(chuàng)傷弧菌的培養(yǎng)條件和外膜蛋白的提取方法進(jìn)行了探討，篩選出最佳的培養(yǎng)溫度和時(shí)間以及提取方法；通過(guò)實(shí)驗(yàn)