人源異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶及真核起始因子2B的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究.pdf

1、1.人源異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究人源異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶(IPP異構(gòu)酶)是異戊二烯類化合物生物合成途徑中的關(guān)鍵性的酶，它催化異戊二烯焦磷酸(IPP)與二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)之間的相互異構(gòu)轉(zhuǎn)化，而異戊二烯焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸則是數(shù)目眾多的異戊二烯類化合物的共同前體。這里我們首先用單波長(zhǎng)反常散射的辦法解析了人源IPP異構(gòu)酶1.6A的晶體結(jié)構(gòu)，其空間群為P212121，并隨后得到了另外兩種不同晶型的晶體結(jié)構(gòu)，空間

2、群分別是C2和P1，其中空間群P1的晶體中是無(wú)機(jī)培養(yǎng)基表達(dá)的硒代蛋白，它們都與大腸桿菌中同源蛋白的結(jié)構(gòu)相似。這些結(jié)構(gòu)首先展示了在人源IPP異構(gòu)酶的N端區(qū)域存在著一個(gè)不穩(wěn)定的α螺旋，在空間群C2和P1的晶體結(jié)構(gòu)中這個(gè)α螺旋是形成的，但是在空間群P212121的晶體結(jié)構(gòu)中卻打開(kāi)成了一個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲，這個(gè)α螺旋覆蓋在IPP異構(gòu)酶活性口袋的上方，可能控制底物的進(jìn)出。然后在空間群P1的晶體結(jié)構(gòu)中，發(fā)現(xiàn)在活性口袋中結(jié)合了一個(gè)可能來(lái)自大腸桿菌的底物類似

3、物焦磷酸乙醇胺(EIPP)，根據(jù)這個(gè)結(jié)構(gòu)我們認(rèn)為IPP異構(gòu)酶催化的底物IPP質(zhì)子化與去質(zhì)子化反應(yīng)中質(zhì)子的供體可能是結(jié)合在活性口袋中的一個(gè)水分子，并且很可能IPP和DMAPP采用不同的構(gòu)象結(jié)合IPP異構(gòu)酶。另外這三個(gè)不同晶型的晶體結(jié)構(gòu)中活性相關(guān)的氨基酸的構(gòu)象并不完全相同，據(jù)此我們認(rèn)為人源IPP異構(gòu)酶中存在著一個(gè)底物誘導(dǎo)的活性位點(diǎn)構(gòu)象變化的過(guò)程。最后根據(jù)空間群P212121的晶體結(jié)構(gòu)，我們提出了一個(gè)高濃度的Mn<'2+>抑制人源IPP異構(gòu)酶

4、活性的機(jī)理。 2.人源真核翻譯起始因子eIF2B的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究真核翻譯起始過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，其主要目的是為了使mRNA能夠結(jié)合在核糖體上并使得起始Met-tRNA<,i>與mRNA上的AUG起始密碼子正確配對(duì)，從而可以開(kāi)始肽鏈的延伸過(guò)程。這個(gè)翻譯起始過(guò)程需要很多蛋白質(zhì)的幫助，它們被稱為真核起始因子(eukaryotic initiation factor，eIF)。其中eIF2是攜帶起始Met-tRNAi結(jié)合到核糖體的重要

5、因子，它只有在結(jié)合GTP時(shí)才能攜帶起始Met-tRNA<,i>，但是正常情況下eIF2對(duì)GDP的親和力要高于GTP，所以這時(shí)就需要一個(gè)烏苷酸交換因子eIF2B的幫助把eIF2-GDP變?yōu)閑IF2-GTP，這個(gè)烏苷酸交換反應(yīng)是整個(gè)翻譯起始過(guò)程最重要的調(diào)控點(diǎn)之一。eIF2B是一個(gè)包含五個(gè)亞基的大復(fù)合物，它又可以分為調(diào)節(jié)亞復(fù)合物和催化亞復(fù)合物，其中由α，β和δ亞基組成的調(diào)節(jié)亞復(fù)合物主要應(yīng)對(duì)eIF2磷酸化對(duì)eIF2B活性的抑制作用，而由γ和ε亞

6、基組成的催化亞復(fù)合物則主要發(fā)揮催化烏苷酸交換的活性。我們表達(dá)純化了人源eIF2Ba亞基并用分子置換的方法解析了其2.6A分辨率的晶體結(jié)構(gòu)，eIF2Bα的結(jié)構(gòu)包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域，根據(jù)以前生化研究的結(jié)果我們描述了eIF2Bα上一個(gè)可能與eIF2或磷酸化eIF2相互作用的表面，并認(rèn)為其C端結(jié)構(gòu)域中的Rossmann折疊花樣可能介導(dǎo)了其與β及δ亞基形成調(diào)節(jié)亞復(fù)合物，除此之外，我們還根據(jù)eIF2Bα的結(jié)構(gòu)提出了其中兩個(gè)被鑒定與