人磷酸二酯酶4B2基因的克隆和異源表達(dá)研究.pdf

1、磷酸二酯酶(PDEs)通過(guò)催化cAMP和cGMP水解，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)第二信使的水平。磷酸二酯酶4特異地水解cAMP，主要存在于中性粒細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞等免疫和炎癥細(xì)胞中。PDE抑制劑可用于治療多種疾病，因此極具市場(chǎng)價(jià)值。PDE4選擇性抑制劑可以用于治療哮喘，慢性阻塞性肺疾病，抑郁，阿爾茨海默氏癥、帕金森氏病等重大疾病。本論文中，克隆并用大腸桿菌和酵母菌表達(dá)人磷酸二酯酶482。所表達(dá)的蛋白將用于建立高通量篩選模型篩選其抑

2、制劑。 人白血病單核細(xì)胞中加入1ng/ml LPS于37℃孵育3小時(shí)后，提取總RNA。以總RNA為模扳，用RT-PCR的方法得到人PDE482編碼區(qū)的基因片段。核苷酸序列分析表明擴(kuò)增的片段與GenBank報(bào)道的序列相差三個(gè)堿基。通過(guò)定點(diǎn)突變得到了正確的編碼序列。將cDNA分別插入表達(dá)載體PET-32a，pPIC9K和pYeDP60扣，并在大腸桿菌和酵母菌中表達(dá)。篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，誘導(dǎo)表達(dá)后得到重組蛋白。Western blot表明