海豚鏈球菌CAMP因子原核表達及生物學特性研究.pdf

1、本研究以斑點叉尾鮰源海豚鏈球菌（Streptococcus iniae，S.iniae）廣西分離株DGX07為實驗菌株提取總DNA作為模板，對CAMP因子基因進行PCR(Polymerase Chain Reaction)擴增;將擴增產物連接至pMD19-T質粒中進行測序，并應用不同的生物信息學軟件對其核酸及氨基酸序列進行分析;將含有限制性內切酶位點的csi基因連接至pMD19-T質粒中，酶切回收后將其連接至表達質粒pET32a(+)上

2、，最終轉化至大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）原核表達系統(tǒng)BL21(DE3)大腸桿菌內;將陽性表達菌株進行CAMP因子重組誘導表達，并優(yōu)化表達條件;用重組CAMP因子蛋白免疫新西蘭大白兔，并進行Western-blot以檢驗該蛋白的免疫原性以及在海豚鏈球菌中的表達情況;用Western-blot檢驗重組CAMP因子對IgG非特異性的粘附;用CAMP因子抗血清探究其對海豚鏈球菌對鯉魚上皮瘤細胞（Epitheliom

3、a papulosum cyprini，EPC）粘附及侵染的抑制水平;用重組CAMP因子與重組金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）鞘磷脂酶(sphingomyelinase)探究其對不同物種血細胞的促溶血特性。
　　核酸及蛋白質序列分析表明，海豚鏈球菌CAMP因子隸屬于CAMP因子超家族，并與其他鏈球菌CAMP因子同源，但是其與親緣關系最近的犬鏈球菌（Streptococcus canis）的相似度僅為63

4、％，且該蛋白質含有60.1％的可變氨基酸，這表明海豚鏈球菌CAMP因子不屬于保守蛋白質;NCBI在線預測軟件分析表明，CAMP因子含有信號肽序列，1個潛在N-糖基化位點，以及16個潛在磷酸化位點;SDS-PAGE顯示，海豚鏈球菌重組CAMP因子的蛋白大小為48kDa，且大腸桿菌原核表達系統(tǒng)在IPTG濃度為0.8mmol/L、37℃下誘導表達5h時，表達水平達到最大;瓊脂擴散實驗結果表明，CAMP因子抗血清效價為1∶32;Western-

5、blot結果顯示，重組CAMP因子具有抗原性，且海豚鏈球菌存在CAMP因子的表達;細胞實驗中，被CAMP因子抗血清中和了的海豚鏈球菌顯示出粘附以及入侵鯉魚上皮瘤細胞能力減弱的現(xiàn)象，其中粘附水平下降至58.4％，而侵入水平下降更多，至42.7％，這表明CAMP因子在海豚鏈球菌侵入機體后粘附并進入上皮細胞中起著較為重要的作用;Western-blot結果顯示，a-烯醇化酶抗血清與CAMP因子預孵育后，其與α-烯醇化酶結合的能力出現(xiàn)下降，這表