感覺(jué)神經(jīng)化促大段骨缺損成骨作用機(jī)制的研究.pdf

1、背景：
　　如何更有效的治療大段骨缺損歷來(lái)是骨科工作者挑戰(zhàn)的一個(gè)難題[1]。采用自體骨移植的方法雖然效果好，但是由于骨量的限制，大多數(shù)病人無(wú)法實(shí)現(xiàn)[2，3]。而應(yīng)用同種異體骨進(jìn)行移植，因?yàn)橛袕?qiáng)烈的免疫反應(yīng)，恢復(fù)的往往很差[4]。隨著材料學(xué)的發(fā)展，人工骨移植的使用逐漸增多，而這個(gè)方法成骨效果差，臨床應(yīng)用仍未取得好的進(jìn)展。近幾年來(lái)，隨著組織工程骨的出現(xiàn)，為大段骨缺損的治療提供了理想的手段[5,6]。
　　然而，雖然相對(duì)于一般的人

2、工骨移植，組織工程骨的成骨作用相對(duì)較好，但仍未達(dá)到期待的水平。近幾年來(lái)對(duì)于提高組織工程骨成骨效果的研究十分火熱，主要方向集中在血液的供給與神經(jīng)的支配兩個(gè)方面。良好的血供可以給組織工程骨提供氧氣與營(yíng)養(yǎng)，以及一些成骨促成因子，所以血管化有助于骨的生長(zhǎng)與再生，這已經(jīng)得到了業(yè)界的廣泛認(rèn)可[7]。但神經(jīng)支配對(duì)于組織工程骨成骨的作用機(jī)制卻并不是很清楚，它需要我們進(jìn)一步的研究。
　　有研究發(fā)現(xiàn)，感覺(jué)神經(jīng)化可以促進(jìn)組織工程骨成骨，其成骨效果與血管

3、化相似，而運(yùn)動(dòng)神經(jīng)化卻沒(méi)有效果[8]。這個(gè)研究結(jié)果表明這兩類(lèi)神經(jīng)對(duì)于組織工程骨的成骨效果是不一樣的。本研究則是基于這一研究結(jié)果，通過(guò)制作大鼠大段骨缺損模型，用小動(dòng)物驗(yàn)證了感覺(jué)神經(jīng)化能促進(jìn)大段骨缺損修復(fù)這一結(jié)論；再通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，來(lái)探討分子機(jī)制；最后通過(guò)對(duì)比感覺(jué)神經(jīng)與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)的不同，篩選出差異蛋白，為進(jìn)一步的研究提供新的方向。
　　目的：
　　探討感覺(jué)神經(jīng)化促進(jìn)大鼠股骨大段骨缺損修復(fù)的機(jī)制，為大段骨缺損治療提供新方法。
　

4、　方法：
　　第一部分：感覺(jué)神經(jīng)化大鼠大段骨缺損模型的制作與修復(fù)效果的觀察
　　采用成年SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在組織工程骨材料上敷上GFP+的BMSCs作為種子細(xì)胞，然后分別制作大段骨缺損空白組、組織工程骨植入組和感覺(jué)神經(jīng)移植組動(dòng)物模型。分別在1周、4周、8周手術(shù)獲取大鼠實(shí)驗(yàn)肢股骨，拍攝X光片和Micro-CT，觀察成骨效果。固定、去除鈣鹽后切片，行HE和共聚焦染色，顯微鏡下拍攝圖片，探究其組織學(xué)變化。
　　第二部分：

5、不同濃度兩種神經(jīng)勻漿對(duì)大鼠BMSCs的影響
　　用顯微外科手術(shù)的方法提取大鼠隱神經(jīng)與坐骨神經(jīng)肌支分別作為感覺(jué)神經(jīng)與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)組織。按每10 mg神經(jīng)加入1 mL成骨誘導(dǎo)液，首先制備10 mg/mL的神經(jīng)勻漿。過(guò)濾提純后10倍稀釋?zhuān)苽涑鰪母叩降?種不同濃度梯度的神經(jīng)勻漿提取液，－80℃凍存?zhèn)溆?。體外培養(yǎng)GFP+大鼠幼鼠BMSCs，常規(guī)培養(yǎng)至第3代后分別加入以上5種濃度梯度的感覺(jué)神經(jīng)勻漿與、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)勻漿作用，14 d后行CCK-8檢測(cè)

6、與ALP染色，觀察BMSCs的增殖與分化情況。
　　第三部分：共培養(yǎng)狀態(tài)下DRG對(duì)BMSCs的影響
　　混合共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：取SD大鼠新生鼠DRG，與GFP+BMSCs混合共培養(yǎng)，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)與變化。
　　隔離共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：取SD大鼠新生鼠DRG，消化后按1×103個(gè)細(xì)胞/Transwell小室的比例，接種感覺(jué)神經(jīng)元細(xì)胞，每個(gè)Transwell接六個(gè)DRG，再將其放入六孔板中，作為實(shí)驗(yàn)組；對(duì)照組六孔板中只加入BMSCs

7、，放入未添加DRG的Transwell小室。由于細(xì)胞自帶綠色熒光，可以隨時(shí)觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)變化，10d后進(jìn)行CCK-8檢測(cè)，成骨相關(guān)抗體染色，拍攝共聚焦圖片。
　　第四部分：iTRAQ技術(shù)篩選小鼠感覺(jué)神經(jīng)、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)的差異蛋白
　　取300只昆明小鼠的坐骨神經(jīng)肌支作為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)，隱神經(jīng)作為感覺(jué)神經(jīng)，各分為兩組，劃分成四組，感覺(jué)神經(jīng)組記為Y1、Y2，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)組記為Z1、Z2。而后兩兩比較，找出兩種不同神經(jīng)的差異。
　　結(jié)果：<

8、br>　　第一部分：感覺(jué)神經(jīng)移植組的成骨效果優(yōu)于空白組，新生骨數(shù)量增加，并且種子細(xì)胞的存活與增殖數(shù)量均顯著多于對(duì)照組。
　　第二部分：CCK-8結(jié)果顯示：濃度位于0.1～1.0 mg/mL的感覺(jué)神經(jīng)勻漿提取液促進(jìn)BMSCs增殖的作用最明顯（P＜0.05）；濃度為10 mg/mL的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)勻漿提取液對(duì)BMSCs增殖的抑制作用明顯（P＜0.05）；ALP染色結(jié)果顯示：兩個(gè)勻漿添加組的著色結(jié)晶數(shù)量都遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于未添加組（P＜0.05）。

9、r>　　第三部分：混合共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中BMSCs細(xì)胞有向感覺(jué)神經(jīng)元遷移、富集的現(xiàn)象發(fā)生；隔離共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，加入DRG共培養(yǎng)的組BMSCs的量顯著高于未添加組（P＜0.05）。BMSCs成骨方向變化的能力加DRG組培養(yǎng)組明顯小于未加組。
　　第四部分：通過(guò)計(jì)算機(jī)對(duì)比測(cè)定，得到差異蛋白1667種。
　　結(jié)論：
　　感覺(jué)神經(jīng)化有促進(jìn)組織工程骨成骨的效果。其作用原理可能在于感覺(jué)神經(jīng)能夠提高 BMSCs增殖的能力，并影響其成骨方向轉(zhuǎn)