FAT10在肝癌和結(jié)腸癌患者血漿中的表達(dá)及診斷價(jià)值分析.pdf

1、背景和目的：肝癌和結(jié)腸癌均是世界范圍內(nèi)常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，在亞太地區(qū)惡性腫瘤死亡率中分別位列第3和第5位。且近年來(lái)，結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率明顯上升。早期肝癌缺乏典型臨床癥狀,癥狀顯著者大多已進(jìn)入中晚期。當(dāng)前，手術(shù)切除是治療肝癌最好的方法。中晚期肝癌的治療方案還包括肝動(dòng)脈栓塞術(shù)（TACE），無(wú)水酒精注射（PEI）和射頻消融術(shù)。盡管存在這些治療方法，但是肝癌的早期診斷仍然是改善患者預(yù)后的重要途徑。甲胎蛋白(α-fetoprotein，A

2、FP)作為肝癌早期診斷的主要血清學(xué)診斷指標(biāo)，因其具有非侵入性的優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用。臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，AFP在早期肝癌和小肝癌診斷中的敏感性和特異性不夠令人滿意。早期肝癌中40％的AFP是陰性的。2010年，美國(guó)肝病研究協(xié)會(huì)（AASLD）在其公布的肝癌診斷指南中，不再使用AFP作為肝癌的篩查指標(biāo)。另外，多數(shù)肝癌疑似患者并不容易接受肝臟穿刺活檢，因?yàn)樗鼘儆谟袆?chuàng)性檢查，組織學(xué)診斷這一金標(biāo)準(zhǔn)在臨床應(yīng)用中受到限制。因此，探索新的血清學(xué)標(biāo)記物應(yīng)用于肝癌和

3、結(jié)腸癌的早期診斷有一定的必要性。
　　FAT10 mRNA（人類白白細(xì)胞抗原信使RNA，human leukocyte antigen-F adjacent transcript10 mRNA）位于人類6號(hào)染色體上，I型主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex,MHC)編碼區(qū)域的末端,緊挨人類白細(xì)胞抗原的F區(qū),由此而得名。FAT10蛋白包含165個(gè)氨基酸殘基，最初因?yàn)槠銫端和N端與泛素

4、蛋白高度相似而被命名為雙泛素蛋白。FAT10蛋白隸屬于類泛素蛋白家族，并且可以通過(guò)蛋白酶體系統(tǒng)參與蛋白質(zhì)的降解過(guò)程。FAT10 mRNA定位于真核生物細(xì)胞核,通過(guò)結(jié)合人類紡錘體檢查位點(diǎn) MAD2參與細(xì)胞周期循環(huán)管理,MAD2的異常調(diào)節(jié)和染色體不穩(wěn)定性有關(guān)。最近發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AT10 mRNA可參與管理細(xì)胞周期循環(huán)、誘導(dǎo)染色體不穩(wěn)定性，參與修飾腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α）等，而染色體不穩(wěn)定性可以

5、導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。我們?cè)谇捌趯?shí)驗(yàn)中,應(yīng)用含有19378個(gè)已知基因的核苷酸芯片篩選出肝癌、肝硬化和病毒性肝炎差異基因表達(dá)圖譜,結(jié)果表明FAT10基因在肝癌中顯著高表達(dá)。有研究證明，炎性環(huán)境下FAT10基因在肝癌和結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)。但是，血漿中FAT10 mRNA及蛋白表達(dá)水平，可否作為肝癌和結(jié)腸癌的一種血清學(xué)診斷標(biāo)志目前還未有研究。
　　在本實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR）技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)方法（EL

6、ISA）測(cè)定FAT10 mRNA和蛋白在肝癌、結(jié)腸癌、肝硬化及健康志愿者血漿中的表達(dá)水平，通過(guò)分析FAT10蛋白在肝癌和結(jié)腸癌診斷中的靈敏度和特異度，評(píng)估其臨床診斷價(jià)值。
　　材料和方法：
　　1.材料：
　　臨床研究資料：70例肝癌血漿樣本取自2014年6月-2015年4月河南省人民醫(yī)院肝膽外科和消化內(nèi)科住院患者,另選同期住院60例肝硬化、64例結(jié)腸癌患者，64例健康志愿者選自體檢中心。70例肝癌中男51例、女19例

7、,年齡54.03歲±8.93歲。所有肝癌患者均進(jìn)行TNM分期,并使用Child-Pugh方法評(píng)估肝臟功能分級(jí)。結(jié)腸癌患者中男38例,女26例,年齡53.55歲±6.56歲,使用Duke's方法進(jìn)行分期。肝癌和結(jié)腸癌患者血樣本收集前均未行放療或化療,依靠超聲、CT，MRI等方法診斷，且經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)。正常對(duì)照組選取同時(shí)期體檢健康志愿者，所有參加研究患者均簽署知情同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。
　　2.方法：
　　2.1

8、PCR：分別提取肝癌、結(jié)腸癌、肝硬化和健康對(duì)照組血漿中總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)A260/A280吸光度比值，若A260/A280在1.8-2.0之間說(shuō)明所提取的RNA純度良好，可進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，隨后嚴(yán)格按照購(gòu)自日本TAKARA公司的RT-PCR試劑盒檢測(cè)不同組別中血漿FAT10 mRNA陽(yáng)性表達(dá)率，PCR反應(yīng)結(jié)束后出現(xiàn)熔解曲線和擴(kuò)增曲線，將CT值在18-35之間定義為表達(dá)陽(yáng)性，利用所得CT值計(jì)算產(chǎn)物相對(duì)表達(dá)量。
　

9、　2.2. ELISA檢測(cè)隨機(jī)選取部分血漿進(jìn)一步進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)選取肝癌血漿70例，肝硬化血漿40例，結(jié)腸癌患者、正常人血漿各32例，實(shí)驗(yàn)前規(guī)劃空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣本孔，嚴(yán)格按照FAT10-ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，利用96孔酶標(biāo)儀測(cè)出每孔相應(yīng)的OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,或者得出四參數(shù)分析公式，通過(guò)已知標(biāo)準(zhǔn)品濃度值計(jì)算樣品濃度值。
　　3.統(tǒng)計(jì)分析
　　FAT10 mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白計(jì)

10、量資料以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(mean士SD)表示。多組之間比較采用方差分析、Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)、Mann-Whitney U檢驗(yàn)。FAT10和AFP與臨床特征之間相關(guān)檢驗(yàn)運(yùn)用Mann-Whitney U檢驗(yàn)或者Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。受試者工作特征曲線（ROC curve）被用于分析FAT10蛋白和AFP蛋白的診斷價(jià)值。應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析肝癌、肝硬化及健康組之間FAT10

11、mRNA和蛋白表達(dá)頻率差異。制圖工具選用GraphPad6.0版（(Graph Pad Software,La Jolla，CA，USA）。雙側(cè)檢驗(yàn)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.FAT10 mRNA在各組中的表達(dá)水平
　　肝癌、肝硬化、健康組血漿FAT10 mRNA的陽(yáng)性表達(dá)率分別為72.85%（51/70），28.3%(17/60)和12.5%(8/64)，三者之間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<

12、0.01)；肝癌組FAT10陽(yáng)性表達(dá)率明顯高與肝硬化組(P<0.01)和正常志愿者(P<0.01)。肝硬化組與健康志愿者比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。三組中FAT10 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為6.83士3.37,2.14士0.70,1.08士0.46,三組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。肝硬化和健康志愿者之間差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。肝癌患者血漿FAT10 mRNA表達(dá)水平與肝癌TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，

13、結(jié)腸癌組中FAT10 mRNA相對(duì)表達(dá)量為4.04士3.33,陽(yáng)性表達(dá)率為59.4%(38/64),與健康組比較差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且FAT10 mRNA上調(diào)表達(dá)與結(jié)腸癌Duke’s分期（P<0.05)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)。FAT10 mRNA在AFP陰性肝癌中的敏感度為68.8%，當(dāng)比較小肝癌和非肝癌組（肝硬化和健康志愿者）時(shí)，發(fā)現(xiàn)其敏感度為68.8%，特異度為79.8%。
　　2.FAT10蛋白

14、表達(dá)水平
　　血漿FAT10蛋白在肝癌、肝硬化、健康志愿者中平均表達(dá)濃度依次是293.855±127.61pg/ml、169.30±58.659pg/ml、142.87±70.08pg/ml。三組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=53.34，P<0.01）。肝癌組分別與肝硬化、健康組比較均具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。肝硬化和健康組比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.086），盡管FAT10蛋白在肝硬化中也有輕度上調(diào)表達(dá)。肝癌血漿中FAT

15、10蛋白濃度高表達(dá)與TNM分期(P=0.034，<0.05)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P=0.032，<0.05）。
　　FAT10蛋白在AFP陰性肝癌，小肝癌的平均表達(dá)濃度依次是271.57±128.68pg/ml、299.71±110.02pg/ml。分別與健康志愿者比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)。血漿FAT10蛋白在結(jié)腸癌的平均表達(dá)濃度是192.806±61.69pg/ml。結(jié)腸癌組和健康組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

16、<0.05），并且FAT10蛋白在結(jié)腸癌中的濃度與結(jié)腸癌患者Duck’s分期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　3.ROC曲線分析結(jié)果
　　利用ROC分析血漿FAT10蛋白濃度結(jié)果，綜合靈敏度和特異度分析診斷方法的準(zhǔn)確度。當(dāng)肝癌與非肝癌組相比較時(shí)，根據(jù)國(guó)際推薦標(biāo)準(zhǔn)，以20ng/ml為AFP臨界值，得出AFP蛋白敏感度和特異度分別為78.6%和81.9%。運(yùn)用ROC曲線，得出FAT10蛋白質(zhì)最佳臨界值為194.14pg/ml,肝癌與健康組相

17、鑒別AUC值為0.874（95%置信區(qū)間：0.800-0.949），敏感度78.6%，特異度87.5%。肝癌與肝硬化相鑒別AUC值為0.826（95%置信區(qū)間：0.749-0.903），敏感度為78.6%，特異度77.5%。小肝癌與非肝癌相鑒別AUC值為0.865（95%置信區(qū)間：0.717-0.955)。當(dāng)小肝癌組與肝硬化相鑒別時(shí)敏感度和特異度分別為75.0%和77.5%、與健康志愿者組相鑒別時(shí)FAT10的敏感度和特異度分別為75.0

18、%和84.4%。聯(lián)合FAT10蛋白和AFP蛋白，診斷敏感度可以上升到81.3%。
　　ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)當(dāng)AFP陰性肝癌與非肝癌組比較時(shí)，AUC值是0.836(95%置信區(qū)間:0.724-0.947)，進(jìn)一步分析當(dāng)AFP陰性肝癌分別與肝硬化、健康組相鑒別均具有較好的診斷意義，AUC值分別為0.797(95%置信區(qū)間：0.660-0.934)、0.884(95%置信區(qū)間：0.785-0.982)；特異度分別為77.5%、87.5%。

19、
　　結(jié)論：
　　1.肝癌組血漿中FAT10 mRNA和蛋白水平較對(duì)照組均明顯增高。FAT10 mRNA與肝癌TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。FAT10蛋白與肝癌的TNM分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。血漿FAT10 mRNA和蛋白在結(jié)腸癌患者中的表達(dá)水平較健康志愿者明顯升高，并且與腫瘤Duke’s分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。這些提示FAT10可能參與肝癌和結(jié)腸癌的發(fā)生和進(jìn)展。
　　2.ROC曲線表明FAT10蛋白作為肝癌無(wú)創(chuàng)性診斷標(biāo)志物