抑制組蛋白去乙?；?1活性誘導(dǎo)大鼠肝移植免疫耐受的機(jī)制研究.pdf

1、目的研究抑制組蛋白去乙?；?1(histone deacetylasesll,HDAC11)活性誘導(dǎo)大鼠肝移植免疫耐受的機(jī)制以及比較使用HDAC11-shRNA誘導(dǎo)免疫耐受與術(shù)后使用免疫抑制劑的優(yōu)越性。
　　 方法(1)改良Kamada"二袖套法"建立(Lewis-BN)大鼠同位肝移植(orthotopic liver transplantation,OLT)急性排斥動(dòng)物模型。將受體BN大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組,干預(yù)組和轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染

2、組以0.1 ml/min的流速于肝移植冷保存期經(jīng)門靜脈持續(xù)灌注HDAC11-shRNA20 min;對(duì)照組以同樣速度同樣時(shí)間經(jīng)門靜脈注入等量生理鹽水;干預(yù)組術(shù)后1～7天以1 mg/kg肌肉注射免疫抑制劑他克莫司(FK506)。觀察術(shù)后7天內(nèi)大鼠生存率,并于術(shù)后第7天活殺受體大鼠取門靜脈血和下腔靜脈血及左肝外葉組織標(biāo)本。HE染色后光鏡下觀察肝臟組織病理學(xué)改變。全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)下腔靜脈血中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanineaminotransf

3、erase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)和總膽紅素(total bilirubin,TBIL)含量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR及蛋白免疫印記法測(cè)定肝組織HDAC11和IL-10 mRNA及蛋白表達(dá)水平。酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清IL-2、IFN-γ和IL-10的含量。HDAC11在各組間表達(dá)情況的比較采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((-x)±sd)表示,用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析,量的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用

4、t檢驗(yàn),率的統(tǒng)計(jì)采用χ2檢驗(yàn),P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果(1)應(yīng)用改良Kamada"二袖套法"成功地建立了(Lewis-BN)大鼠原位肝移植排斥動(dòng)物模型。(1)對(duì)照組、干預(yù)組和轉(zhuǎn)染組7天內(nèi)生存率分別為30％、70%和90%,轉(zhuǎn)染組明顯高于干預(yù)組和對(duì)照組(P＜0.05),干預(yù)組高于對(duì)照組(P＜0.05)。(2)根據(jù)RAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),術(shù)后第7天對(duì)照組、干預(yù)組和耐受組病理改變分別為重度急性排斥反應(yīng)、不確定的急性排斥反

5、應(yīng)和無(wú)急性排斥反應(yīng)。(3)對(duì)照組、干預(yù)組和轉(zhuǎn)染組血清ALT含量分別為963.43±64.21U/L、634.73±43.28U/L和198.23±13.82;AST分別為742.46±52.71U/L、438.36±45.34U/L和115.79±21.23U/L;TBIL分別為94.64±14.35μmol/L、55.42±15.45μmol/L和15.3±0.56μmol/L;干預(yù)組血漿ALT、AST以及TBIL水平較對(duì)照組降低,差

6、異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而轉(zhuǎn)染組含量更低,明顯低于對(duì)照組和干預(yù)組(P＜0.05)。(4)Real-Time PCR和Western blot檢測(cè)HDAC11和IL-10 mRNA在肝組織中表達(dá)水平,結(jié)果顯示:對(duì)照組、干預(yù)組和轉(zhuǎn)染組HDAC11和IL-10 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.91±0.22、0.52±0.13、0.24±0.06和0.29±0.04、0.58±0.17、1.17±0.36。蛋白表達(dá)量分別為1.73±0.2

7、1、0.75±0.12、0.42±0.06和0.49±0.04、1.02±0.16、2.45±0.28。干預(yù)組HDAC11表達(dá)量低于對(duì)照組(P＜0.05):轉(zhuǎn)染組HDAC11表達(dá)量明顯低于干預(yù)組和對(duì)照組(P＜0.05)。而IL-10則在轉(zhuǎn)染組表達(dá)最多,明顯高于干預(yù)組和對(duì)照組(P＜0.05),干預(yù)組高于對(duì)照組(P＜0.05)。ELISA結(jié)果表明:對(duì)照組、干預(yù)組和轉(zhuǎn)染組IL-2和IFN-γ表達(dá)量分別為154.67±14.66、62.83±9

8、.58、28.49±3.97和93.78±11.62、54.23±8.58、20.65±3.45。IL-10表達(dá)量分別為12.33±1.58、34.48±4.10和67.50±9.39。干預(yù)組IL-2和IFN-γ含量低于對(duì)照組(P＜0.05),而轉(zhuǎn)染組更低,和對(duì)照組和干預(yù)組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。相反,耐受組IL-10含量明顯高于干預(yù)組和對(duì)照組(P＜0.05),干預(yù)組高于對(duì)照組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論(1)抑制大