長(zhǎng)臀鮠精子形態(tài)和差異蛋白及DMRT1與VASA基因的研究.pdf

1、長(zhǎng)臀鮠Cranoglanis bouderius（Richardson）是近年來(lái)開(kāi)始人工馴養(yǎng)的名貴經(jīng)濟(jì)魚(yú)類養(yǎng)殖新品種。但到目前為止，長(zhǎng)臀鮠規(guī)?；斯し敝臣夹g(shù)一直沒(méi)有取得突破，野生種質(zhì)資源已枯竭。針對(duì)長(zhǎng)臀鮠自然水體中能實(shí)現(xiàn)繁殖，而人工養(yǎng)殖條件下，人工繁殖雌雄配對(duì)困難、受精率低下等技術(shù)瓶頸問(wèn)題，本研究計(jì)劃從長(zhǎng)臀鮠精子的相關(guān)生物學(xué)特性開(kāi)展研究，包括長(zhǎng)臀鮠精子分離純化及形態(tài)觀察、差異蛋白及性別決定與分化相關(guān)基因DMRT1及VASA的表達(dá)特征。期

2、望通過(guò)本研究為解決長(zhǎng)臀鮠人工繁殖技術(shù)瓶頸問(wèn)題提供理論支持，探索出的方法可作為其它人工繁殖困難魚(yú)類相應(yīng)研究時(shí)的參考。本論文采用的方法及其研究結(jié)果包括：
　?、倮妹芏忍荻冉寝D(zhuǎn)離心對(duì)長(zhǎng)臀鮠精子進(jìn)行分離純化，結(jié)果表明采用3層（30％，60%及70%）非連續(xù)Percoll密度梯度離心能高效的分離純化長(zhǎng)臀鮠精子，純化后的精子保持較高的活力，細(xì)胞膜也較完整。
　　②通過(guò)光學(xué)顯微技術(shù)結(jié)合電子顯微鏡觀察，長(zhǎng)臀鮠精子分為頭部、中段、尾段鞭毛三

3、部分。在透射電子顯微鏡下，精子頭部為核物質(zhì)部分，其細(xì)胞核為馬蹄形，有植入窩、核泡，無(wú)頂體、頂體囊。精子中段充滿了細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞器：細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)有胞質(zhì)通道，胞質(zhì)通道中存在囊泡與鞭毛基融合現(xiàn)象，可能參與了微管的轉(zhuǎn)運(yùn)與組裝；細(xì)胞器中的中心粒復(fù)合體位于植入窩中央，彼此呈銳角排列。精子尾段鞭毛具有典型的9+2結(jié)構(gòu)，為無(wú)側(cè)鰭單鞭毛。長(zhǎng)臀鮠精子發(fā)生屬Ⅲ型。
　?、弁ㄟ^(guò)iTRAQ技術(shù)對(duì)長(zhǎng)臀鮠成熟精子及未成熟精細(xì)胞進(jìn)行差異蛋白研究?？偣茶b定到1941

4、個(gè)可信蛋白質(zhì)，其中差異蛋白有361個(gè)，157個(gè)上調(diào)，下調(diào)204個(gè)。分別根據(jù)Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋對(duì)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位和分子功能以及各種蛋白參與的生物學(xué)過(guò)程進(jìn)行分析，針對(duì)存在的差異蛋白進(jìn)行了初步探討。經(jīng)KEGG Pathaway注釋對(duì)蛋白質(zhì)的信號(hào)通路進(jìn)行分析，共涉及235種信號(hào)通路，為深入研究精子發(fā)生的分子機(jī)制提供了豐富的信息，其中TCA信號(hào)通路與精子能量代謝有關(guān)，共有5種差異蛋白：IDH、PEPCK、α-KGDHC復(fù)合體

5、（OGDH、DLST和 DLD）。EABB信號(hào)通路涉及的PLCγ、PAK、Raf及GSK-3差異蛋白均對(duì)精子發(fā)生有重要作用。
　?、芾肦ACE方法克隆得到了長(zhǎng)臀鮠DMRT1及VASA基因全長(zhǎng)cDNA，DMRT1基因存在3個(gè)轉(zhuǎn)錄本，分別命名為cbDMRT1a、cbDMRT1b、cbDMRT1c，三者之間最主要差別表現(xiàn)在3′UTR區(qū)，DM結(jié)構(gòu)域高度保守。VASA基因存在2個(gè)轉(zhuǎn)錄本，分別命名為cbVASAa、cbVASAb，兩者僅在5

6、′UTR上存在差異，DEAD-box結(jié)構(gòu)域同源保守性極高。不同的轉(zhuǎn)錄本間可能存在選擇性剪切，參與不同生理調(diào)控過(guò)程。通過(guò)熒光定量PCR對(duì)DMRT1基因的表達(dá)模式研究，發(fā)現(xiàn)其在性腺中特異表達(dá)，精巢表達(dá)量大大高于其它組織。通過(guò)FISH原位雜交法分別以DMRT1三個(gè)轉(zhuǎn)錄本及VASA基因設(shè)計(jì)。雜交結(jié)果顯示長(zhǎng)臀鮠DMRT1基因的三個(gè)轉(zhuǎn)錄本在精巢中生殖細(xì)胞中有大量表達(dá)，包括精原細(xì)胞和精細(xì)胞；cbDMRT1b和cbDMRT1c在除了精巢生殖細(xì)胞外其他組

7、織中均有較強(qiáng)的雜交信號(hào)；cbDMRT1c主要在精原細(xì)胞中分布。而這三者在卵細(xì)胞中也有微弱表達(dá)，且表達(dá)的趨勢(shì)是隨著卵細(xì)胞的發(fā)育逐漸從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移。VASA基因在長(zhǎng)臀鮠性腺中有較高的表達(dá)量，其表達(dá)模式為在卵巢的Ⅰ、Ⅱ時(shí)相的卵母細(xì)胞中有較強(qiáng)的雜交信號(hào)，在整個(gè)卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中均勻分布。隨著卵母細(xì)胞的發(fā)育，Vasa的雜交信號(hào)逐漸衰減直至消失。在精巢中也有相同的趨勢(shì)，在精原細(xì)胞中檢測(cè)得到較強(qiáng)雜交信號(hào)，在精細(xì)胞中信號(hào)消失。充分表明這兩個(gè)基因