長臀鮠精子形態(tài)和差異蛋白及DMRT1與VASA基因的研究.pdf

1、長臀鮠Cranoglanis bouderius（Richardson）是近年來開始人工馴養(yǎng)的名貴經濟魚類養(yǎng)殖新品種。但到目前為止，長臀鮠規(guī)?；斯し敝臣夹g一直沒有取得突破，野生種質資源已枯竭。針對長臀鮠自然水體中能實現(xiàn)繁殖，而人工養(yǎng)殖條件下，人工繁殖雌雄配對困難、受精率低下等技術瓶頸問題，本研究計劃從長臀鮠精子的相關生物學特性開展研究，包括長臀鮠精子分離純化及形態(tài)觀察、差異蛋白及性別決定與分化相關基因DMRT1及VASA的表達特征。期

2、望通過本研究為解決長臀鮠人工繁殖技術瓶頸問題提供理論支持，探索出的方法可作為其它人工繁殖困難魚類相應研究時的參考。本論文采用的方法及其研究結果包括：
　　①利用密度梯度角轉離心對長臀鮠精子進行分離純化，結果表明采用3層（30％，60%及70%）非連續(xù)Percoll密度梯度離心能高效的分離純化長臀鮠精子，純化后的精子保持較高的活力，細胞膜也較完整。
　?、谕ㄟ^光學顯微技術結合電子顯微鏡觀察，長臀鮠精子分為頭部、中段、尾段鞭毛三

3、部分。在透射電子顯微鏡下，精子頭部為核物質部分，其細胞核為馬蹄形，有植入窩、核泡，無頂體、頂體囊。精子中段充滿了細胞質及細胞器：細胞質中發(fā)現(xiàn)有胞質通道，胞質通道中存在囊泡與鞭毛基融合現(xiàn)象，可能參與了微管的轉運與組裝；細胞器中的中心粒復合體位于植入窩中央，彼此呈銳角排列。精子尾段鞭毛具有典型的9+2結構，為無側鰭單鞭毛。長臀鮠精子發(fā)生屬Ⅲ型。
　?、弁ㄟ^iTRAQ技術對長臀鮠成熟精子及未成熟精細胞進行差異蛋白研究。總共鑒定到1941

4、個可信蛋白質，其中差異蛋白有361個，157個上調，下調204個。分別根據Gene Ontology數據庫的注釋對蛋白質的亞細胞定位和分子功能以及各種蛋白參與的生物學過程進行分析，針對存在的差異蛋白進行了初步探討。經KEGG Pathaway注釋對蛋白質的信號通路進行分析，共涉及235種信號通路，為深入研究精子發(fā)生的分子機制提供了豐富的信息，其中TCA信號通路與精子能量代謝有關，共有5種差異蛋白：IDH、PEPCK、α-KGDHC復合體

5、（OGDH、DLST和 DLD）。EABB信號通路涉及的PLCγ、PAK、Raf及GSK-3差異蛋白均對精子發(fā)生有重要作用。
　?、芾肦ACE方法克隆得到了長臀鮠DMRT1及VASA基因全長cDNA，DMRT1基因存在3個轉錄本，分別命名為cbDMRT1a、cbDMRT1b、cbDMRT1c，三者之間最主要差別表現(xiàn)在3′UTR區(qū)，DM結構域高度保守。VASA基因存在2個轉錄本，分別命名為cbVASAa、cbVASAb，兩者僅在5

6、′UTR上存在差異，DEAD-box結構域同源保守性極高。不同的轉錄本間可能存在選擇性剪切，參與不同生理調控過程。通過熒光定量PCR對DMRT1基因的表達模式研究，發(fā)現(xiàn)其在性腺中特異表達，精巢表達量大大高于其它組織。通過FISH原位雜交法分別以DMRT1三個轉錄本及VASA基因設計。雜交結果顯示長臀鮠DMRT1基因的三個轉錄本在精巢中生殖細胞中有大量表達，包括精原細胞和精細胞；cbDMRT1b和cbDMRT1c在除了精巢生殖細胞外其他組

7、織中均有較強的雜交信號；cbDMRT1c主要在精原細胞中分布。而這三者在卵細胞中也有微弱表達，且表達的趨勢是隨著卵細胞的發(fā)育逐漸從細胞質向細胞核內轉移。VASA基因在長臀鮠性腺中有較高的表達量，其表達模式為在卵巢的Ⅰ、Ⅱ時相的卵母細胞中有較強的雜交信號，在整個卵母細胞的細胞質中均勻分布。隨著卵母細胞的發(fā)育，Vasa的雜交信號逐漸衰減直至消失。在精巢中也有相同的趨勢，在精原細胞中檢測得到較強雜交信號，在精細胞中信號消失。充分表明這兩個基因