許氏平鲉性別相關(guān)基因Sox3、Sox9和Dmrt1的研究.pdf

1、許氏平鲉(Sebastes schlegeli)具有抗病力強(qiáng),個(gè)體大,生長(zhǎng)速度快,卵胎生等優(yōu)勢(shì),現(xiàn)已成為我國(guó)北方重要的養(yǎng)殖魚(yú)類。然而,對(duì)于其性別決定和性腺發(fā)育機(jī)制了解的還很少。對(duì)許氏平鲉性別相關(guān)基因的研究,將有助于今后繁殖和育種工作的開(kāi)展。另外,以卵胎生機(jī)制的許氏平鲉為研究對(duì)象,也將有利于我們更好地理解魚(yú)類性別決定機(jī)制。本研究從性腺分化相關(guān)的幾個(gè)關(guān)鍵基因入手,通過(guò)同源克隆和RACE技術(shù)獲得了許氏平鲉Sox3、Sox9及Dmrt1基因全長(zhǎng)

2、cDNA,研究了這3個(gè)基因的結(jié)構(gòu)、啟動(dòng)子序列及在成體不同組織和發(fā)育時(shí)期的時(shí)空表達(dá)情況。并從表觀遺傳學(xué)水平研究了許氏平鲉Sox3基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化水平與基因表達(dá)差異的關(guān)系。同時(shí),對(duì)許氏平鲉GnRH-I進(jìn)行了原核表達(dá),通過(guò)體內(nèi)注射研究了這3個(gè)基因在未成熟許氏平鲉性腺中的表達(dá)變化情況。另外,本文還研究了許氏平鲉在仔魚(yú)發(fā)育時(shí)期和成體不同組織中內(nèi)參基因的表達(dá)變化,篩選出了合適的內(nèi)參體系。具體結(jié)果總結(jié)如下:
　　(1)本研究通過(guò)geN

3、orm、NormFinder和Bestkeeper三種不同的軟件對(duì)許氏平鲉8個(gè)候選內(nèi)參基因(18S rRNA、ACTB、GAPDH、TUBA、RPL17、EF1A、HPRT和B2M)的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行了分析,并在不同組織和仔魚(yú)發(fā)育時(shí)期篩選出了最優(yōu)的內(nèi)參基因:RPL17和EF1A。
　　(2)許氏平鲉Sox3基因cDNA全長(zhǎng)1386 bp,包括906 bp的ORF(301 aa),197 bp的5’UTR和283 bp的3’UTR。編

4、碼蛋白含有保守的HMG結(jié)構(gòu)域。多個(gè)生物信息學(xué)軟件分析許氏平鲉Sox3基因啟動(dòng)子區(qū)存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),包括轉(zhuǎn)錄激活蛋白AP-1、GATA-3、八聚體結(jié)合蛋白Oct-1、叉頭框蛋白FOXD3、同源盒基因PBX1、肝細(xì)胞核因子HNF4、HNF3β、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白C/EBP、GATA-1、GATA-3、GATA、核因子NF-1、特化蛋白Sp1、上游刺激因子USF及性別相關(guān)蛋白SRY、Sox5、Sox9等結(jié)合位點(diǎn)。另外,從分子遺

5、傳學(xué)水平上分析了許氏平鲉Sox3基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化組織差異模式,可知該基因CpG島甲基化水平跟組織差異表達(dá)量不相關(guān)。實(shí)時(shí)定量PCR顯示,許氏平鲉Sox3基因在仔魚(yú)發(fā)育時(shí)期(出生后1、5、10、15、25、35天)都有不同程度的表達(dá),并呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢(shì);在成體性腺中表現(xiàn)出性別兩相性差異,即在卵巢中的表達(dá)強(qiáng)于精巢。組織切片原位雜交顯示該基因的mRNA主要定位于卵巢的卵母細(xì)胞和濾泡細(xì)胞,在精巢的生殖細(xì)胞中也有微量表達(dá)。
　　

6、(3)許氏平鲉Sox9基因cDNA全長(zhǎng)2039 bp,包括1461bp的ORF,336 bp的5’UTR和242 bp的3’UTR。其編碼產(chǎn)物(486 aa)含有保守的HMG結(jié)構(gòu)域。生物信息學(xué)軟件分析Sox9基因啟動(dòng)子區(qū)存在很多與Sox3基因啟動(dòng)子共同的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),如AP-1、GATA-3、Oct-1、 FOXD3及性別相關(guān)基因SRY、Sox5、Sox9等蛋白結(jié)合位點(diǎn)。實(shí)時(shí)定量PCR顯示,該基因在性腺分化的敏感時(shí)期(出生后25-3

7、0天)表達(dá)量達(dá)到較高水平;在成體性腺中顯示了性別兩相性差異,即在精巢中的表達(dá)高于卵巢。組織切片原位雜交顯示該基因定位于精巢的生殖細(xì)胞和Sertoli細(xì)胞,卵巢的卵母細(xì)胞和濾泡細(xì)胞中。
　　(4)許氏平鲉Dmrt1基因cDNA全長(zhǎng)1587 bp,包括909 bp的ORF,189 bp的5’UTR和489 bp3’UTR。該基因編碼產(chǎn)物(302 aa)含有保守的DM結(jié)構(gòu)域和MSM結(jié)構(gòu)域。通過(guò)多個(gè)生物信息學(xué)軟件較準(zhǔn)確的確定了Dmrt1基

8、因啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),包括AP-1、GATA-1、GATA-2、GATA-3、Oct-1、FOXD3、STATx、C/EBPa和GATAx。同Sox9和Sox3基因一樣,在Dmrt1啟動(dòng)子中也存在SRY、Sox5和Sox9性別相關(guān)蛋白結(jié)合位點(diǎn)。實(shí)時(shí)定量PCR分析顯示,許氏平鲉Dmrt1在所有檢測(cè)的仔魚(yú)發(fā)育階段(出生后1、5、10、15、25、35天)都有表達(dá),且表達(dá)量呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢(shì);在成體不同組織中,該基因只在性腺中專一表

9、達(dá),且在精巢中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于卵巢。細(xì)胞定位顯示該基因只存在于精巢和卵巢的生殖細(xì)胞中,在體細(xì)胞中則不表達(dá)。
　　(5)將SsGnRH-I融合蛋白腹腔注射性腺未成熟的許氏平鲉,分析了注射0 h、8 h、16 h、24 h、48 h后這3個(gè)基因在性腺中的表達(dá)變化情況。發(fā)現(xiàn)注射后24 h,Sox9和Dmrt1基因在精巢中的表達(dá)水平顯著升高,而在卵巢中的表達(dá)水平變化不明顯。Sox3基因則在許氏平鮋兩性性腺中的表達(dá)水平均升高,且在卵巢中的變