青鳉性腺發(fā)育的組織學觀察和DMY、Dmrt1基因的表達分析.pdf

1、青鳉(Oryzias latipes)體型小巧,是比較受歡迎的小型寵物魚。因其繁殖力強且繁殖周期短、產(chǎn)卵量大、透明度高、受精情況易辨別、胚胎發(fā)育速度快、對水質(zhì)敏感等特點,越來越被廣泛應用于發(fā)育生物學、分子生物學以及毒理學等研究領域,是研究脊椎動物生殖細胞增殖、遺傳突變和疾病以及污染物的致毒效應等的良好模式生物。為了更加詳細的獲得青鳉性別決定和控制的基礎資料,本研究從三個方面進行闡述:一是利用特異性引物對青鳉的遺傳性別進行鑒定;二是用蘇木

2、精-伊紅(HE)染液對青鳉不同發(fā)育階段的組織切片進行染色觀察,獲得青鳉全面的性腺發(fā)育資料;三是通過實時熒光定量技術檢測DMY和Dmrt1基因在雌雄個體內(nèi)的表達差異,并結合青鳉不同發(fā)育時期的性腺組織切片觀察,對它們在性別決定中的功能進行闡述。主要結果如下:
　　1.利用特異性引物鑒定青鳉的遺傳性別
　　現(xiàn)在已經(jīng)有許多關于青鳉遺傳性別鑒定方法的報道,但是這些已知的方法需要兩對特異性引物,而且,通過此類方法來鑒定青鳉的遺傳性別容易

3、出現(xiàn)錯誤。我們利用Jawa har等設計的這對引物,優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)不僅能夠鑒出成魚的遺傳性別,對胚胎和幼魚也同樣適用。但我們用這對引物鑒定青鳉的遺傳性別,得到異于前人的結果(雄性兩條帶,一條片段大小為933bp,另一條片段大小為1906bp;雌性僅僅擴增出一條片段大小為1906bp的帶),經(jīng)分析后,我們認為我們的結果更加準確。這對依賴于青鳉遺傳性別的生態(tài)和生物醫(yī)學的研究都大有裨益。
　　2.青鳉各個時期性腺組織的發(fā)育和分化
　　

4、本文以青鳉孵化后不同時期的生殖腺為材料,經(jīng)石蠟切片和HE染色后,光學顯微鏡下觀察了青鳉性腺從出現(xiàn)、分化到成熟的發(fā)育過程。結果發(fā)現(xiàn):孵化后5-10天的仔魚腹腔右側已經(jīng)可以觀察到生殖腺,生殖腺中的生殖細胞體積明顯比周圍的體細胞大;孵化后10天,青鳉的性腺開始分化,雌、雄性個體的性腺出現(xiàn)結構上的差異,在雌性生殖腺內(nèi)可以明顯觀察到生殖包囊結構;隨后,在青鳉雌、雄性生殖腺內(nèi)先后觀察到卵子和精子的發(fā)生過程;孵化后50天,首次觀察到卵巢腔結構和成熟的

5、精子。除此之外,我們還觀察到兩性特征共存的現(xiàn)象,即,在遺傳性別為雄性的生殖腺內(nèi),同時觀察到卵母細胞和精子結構。這些實驗結果將為發(fā)育生物學、遺傳生物學提供有價值的信息和珍貴的基礎資料。
　　3.DMY、Dmrt1基因的表達分析
　　目前,對DM Y基因是青鳉雄性性腺發(fā)育起始的“開關”基因已經(jīng)有了較統(tǒng)一的認識;另一個關于青鳉性別控制的“明星”基因是D mr t1。這兩個基因都是青鳉雄性性腺發(fā)育的控制因子。但是,目前,我們并不清楚

6、DMY基因是如何控制青鳉雄性睪丸發(fā)育和分化的,我們也不清楚 D mr t1基因是如何參與到青鳉雄性性腺發(fā)育、分化和成熟的過程中。在本研究中,我們將青鳉性腺發(fā)育的組織學觀察與DMY、Dmrt1基因的表達分析相結合,檢測DMY和Dmrt1基因在青鳉雌雄性個體內(nèi)的表達差異,期望能夠發(fā)現(xiàn)這兩個基因在青鳉性腺發(fā)育、分化和成熟時所起的作用。結果顯示,DM Y基因在青鳉雌雄性個體受精后的10天、15天內(nèi)表達量基本持平,直到青鳉雌雄個體的性腺開始出現(xiàn)形