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文檔簡介
1、蘇云金茅胞桿菌(Bacillus thuringiensis,簡稱Bt),是一種革蘭氏陽性細菌,具有高度特異的殺蟲活性。幾十年的應用實踐表明,Bt制劑及轉Bt殺蟲基因植物是最為有效的農業(yè)害蟲生物防治手段之一。稻飛虱一直以來都是危害水稻的重要害蟲,經常性爆發(fā)成災,給水稻的安全生產構成嚴重威脅,而且生產上對稻飛虱的防控主要依賴化學農藥,致使稻飛虱的抗藥性增強而再猖獗危害,同時導致嚴重的環(huán)境污染和食品安全問題。為此,如何實現稻飛虱的高效綠色防
2、控是一個亟待解決的熱點問題和應用型難題。但是,迄今對稻飛虱有高殺蟲活性的Bt基因資源的發(fā)掘仍是空白,嚴重阻礙了Bt殺蟲譜的拓展與大面積推廣應用。
本論文從建立標準生測體系和廣泛篩選、鑒定批量Bt菌株對稻飛虱的殺蟲活性入手,成功獲得一株對灰飛虱(Laodelphax striatellus,small brown planthopper,SBPH)有高效殺蟲活性的Bt菌株,并進行了新殺蟲活性基因的挖掘與功能驗證。
1.
3、篩選對灰飛虱有殺蟲活性的Bt菌株
改良傳統的稻飛虱生測方法?;绎w虱對濕度反應比較敏感,因北方空氣干燥,即使在恒溫恒溫光照培養(yǎng)箱中,濕度控制也不能滿足灰飛虱生測需要,對照組死亡率常達到20%以上。改進后的生測系統采用透明塑料瓶,瓶底加入2%瓊脂糖凝膠,保證了良好的濕度環(huán)境。經過改良后的生測體系,對照組死亡率可以控制在10%以下。而且,此裝置瓶身、瓶蓋可分離,更利于更換飼料,方便大批量操作,為殺蟲基因的高通量篩選奠定了堅實基礎。<
4、br> 高殺蟲活性菌株篩選。以改良后的生測體系為基礎,利用添加了Bt晶體蛋白的人工飼料飼喂灰飛虱,測定了來自中國農業(yè)科學院植物保護研究所生物技術組保存的68株候選Bt菌株對灰飛虱的殺蟲活性。成功獲得一株對灰飛虱有高毒力(校正死亡率大于90%)的Bt菌株(IPPBI0TSUC1012)。
2.挖掘、鑒定對灰飛虱有殺蟲活性的Bt新基因
殺蟲蛋白的純化與活性測定。從IPPBI0TSUC1012菌株提取的Bt蛋白樣品經過凝
5、膠過濾層析分離,將不同時間出峰的蛋白樣品分別進行殺蟲活性的測定,同時利用SDS-PAGE檢測蛋白質條帶。聯合樣品中蛋白濃度(通過凝膠條帶的灰度值進行量化)及殺蟲活性的大小(試蟲校正死亡率)進行相關分析,明確了2條與殺蟲活性高度相關的蛋白條帶(r=0.83),1條與殺蟲活性中度相關的蛋白條帶(r=0.66)。
Bt基因組測序與新基因挖掘。利用454及illumina測序平臺對IPPBI0TSUC1012菌株基因組進行測序,拼接后
6、得到大小5.51 M的基因組草圖,共39個Scaffold。基因組序列經過GeneMark.hmm PROKARYOTIC的預測一共預測到6063個蛋白質編碼基因。上述基因經過Uniport數據庫的注釋以后,產生5846條注釋結果,絕大多數(96.4%)預測到的蛋白質編碼基因有注釋信息。利用“Cry,Cyt及VIP”對注釋結果進行檢索,只有“Cry”返回兩條檢索數據,分別為Translation5511312..5512181(dire
7、ct),290 aminoacids; Translation5512497..5513384(direct),296 amino acids,并且對應同一條注釋信息,在Uniport數據庫中此序列的Primary accession number為D4QGQ7(Cry64Aa1)。將基因組中預測的蛋白質編碼序列,構建成為Mascot本地數據庫,進行質譜結果的檢索,上述兩條與殺蟲活性高度相關的蛋白條帶,分別匹配基因組里注釋信息為D4QG
8、Q7的兩條蛋白序列,分別命名為Small Brown Plant Hopper Toxin-1和Small BrownPlant Hopper Toxin-2,簡稱ST-1、ST-2。ST-1和ST-2兩個蛋白氨基酸序列之間具有51%的序列相似性。ST-2序列和Cry64Aa1、Cry33Aa1、Cry15Aa分別有45%、36%和31%的序列相似性。
3.高活性Bt新基因的功能驗證
ST-1和ST-2兩個基因的異源
9、原核表達、純化與活性測定。利用pHT-1A載體,構建3個重組質粒,兩個質粒分別包含ST-1、ST-2兩個基因,一個質粒同時連入兩個基因進行共表達。質粒最終通過電擊轉化到Bt無晶體突變株HD73-,單獨存在的ST-1、ST-2基因并不表達,但兩個基因共表達成功。利用共表達的粗蛋白進行生測(濃度分別為5.27和5.13μg/mL),持續(xù)6d灰飛虱校正死亡率為90%。對提取的粗蛋白,先后經過凝膠過濾層析及離子交換進行純化,純化后的蛋白濃縮,透
10、析脫鹽后對灰飛虱及白背飛虱(Sogatella furcifera)進行殺蟲活性測定表明,兩蛋白對兩種試蟲都表現出較高的殺蟲活性,對灰飛虱的毒力回歸方程式為y=3.67x+3.62,對白背飛虱的毒力回歸方程為y=3.95x+2.99。利用SPSS Probit回歸計算LC50分別為3.15μg/g、2.14μg/g,95%置信區(qū)間分別為2.12-3.80μg/g、1.18-2.57μg/g。ST-1和ST-2在已知的Bt蛋白對半翅目昆蟲
11、的活性研究中,僅次于Vip1/Vip2二元毒素,而對稻飛虱是目前發(fā)現的活性最高的Bt殺蟲蛋白。ST-1和ST-2在濃度為300μg/g時,對鱗翅目二化螟(Chilosuppressalis)、小菜蛾(Plutella xylostella、鞘翅目大猿葉甲(Colaphellus bowringi均無殺蟲活性,說明蛋白的殺蟲活性具有高度特異性。
研究表明,ST-1和ST-2同時包含ETX-MTX2結構域,據文獻報道,ETX-MT
12、X2蛋白家族,以及Toxin_10家族的蛋白可能同時含有aerolysin中類似的β折疊結構,基于類似的結構特點,推斷它們可能具有共同的成孔毒素的特性,而且對半翅目昆蟲會有殺蟲活性。研究結果填補了Bt蛋白對稻飛虱無高效殺蟲活性的空白,拓展了Bt蛋白殺蟲譜,將有望革新對半翅目害蟲的防治手段,也為稻飛虱的綠色防控開辟了新途徑。
4.基于中腸轉錄組的Bt受體及相關功能基因分析
灰飛虱中腸轉錄組測序與分析。灰飛虱中腸轉錄組經
13、過去除低質量reads,最后一共產生26,404,470條平均長度90 bp的clean reads,經過Trinity拼接后一共產生了31,435條scaffold,其中15792條(50%)同NCBI已知蛋白序列有顯著的相似性(Evalue<10-5)并提交NCBI SRA數據庫accession number為SRX274939。對注釋后的基因進行GO及COG分析,同時比較了灰飛虱全蟲轉錄組,將表達量顯著高于全蟲的灰飛虱中腸基因挑
14、出,進行GO分析發(fā)現分子功能中有兩類蛋白“Binding”和“Catalyticactivity”有最多的分類數量,反映了中腸的生理功能,對食物的消化與轉運,結合及催化活性有密切聯系。同時,在轉錄組中發(fā)現了Bt蛋白的常見受體,如Aminopeptidase N(APN),Alkaline phosphatase(ALP),Cadherin(CAD)等。研究結果為進一步篩選對灰飛虱有殺蟲活性的Bt新基因及受體基因,并明確其作用機理奠定了分
15、子生物學基礎。
魚尼丁受體基因(Ryanodine receptor,RyR)挖掘。利用灰飛虱、煙粉虱(Bemisia tabaci),二化螟,小菜蛾和稻縱卷葉螟(Cnaphalocrocis medinalis)5種農業(yè)昆蟲的轉錄組數據進行RyR受體基因挖掘。通過RyR片段定位信息,設計引物擴增基因片段,利用Rapid-amplification of cDNA ends(RACE)技術獲得末端片段序列,拼接所有獲得的序列成
16、為全長基因。5個物種中獲得3條基因全長,1個完整的開放閱讀框序列,1個半長序列。經過Northern Blot驗證了序列存在于mRNA轉錄本。對本研究獲得的RyR基因進行了序列分析,克隆的基因序列包括了RyR基因的2個EF-Hand,6個跨膜區(qū)域,最終在羧基端成孔序列的附近發(fā)現了N4968、N4970、N4981、S5004、L5027、N5059和R5076,這7個鱗翅目害蟲專有位點。鑒于二酰胺類農藥對鱗翅目昆蟲有著高毒力,而且RyR
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