二化螟堿性神經(jīng)酰胺酶和中性鞘磷脂酶生化特征及其生理功能研究.pdf

1、堿性神經(jīng)酰胺酶和中性鞘磷脂酶是調(diào)節(jié)生物體內(nèi)鞘脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶類。鞘磷脂酶能水解神經(jīng)鞘磷脂生成神經(jīng)酰胺和磷酸膽堿，神經(jīng)酰胺酶水解神經(jīng)酰胺生成游離脂肪酸和神經(jīng)鞘氨醇，這些鞘脂質(zhì)在生物體內(nèi)具有非常重要的生理作用。前期研究發(fā)現(xiàn):堿性神經(jīng)酰胺酶通過調(diào)控神經(jīng)酰胺水平在果蠅的發(fā)育、生殖和存活中發(fā)揮重要的生理作用。在此基礎(chǔ)上，我們提出神經(jīng)酰胺酶和鞘磷脂酶能夠調(diào)控二化螟體內(nèi)神經(jīng)酰胺水平，在二化螟的發(fā)育扣存活過程中發(fā)揮重要作用的設(shè)想。本研究以重要農(nóng)業(yè)害蟲二

2、化螟為研究對象，對二化螟的堿性神經(jīng)酰胺酶和中性鞘磷脂酶的生化特征進行了研究，并初步探索了它們在二化螟體內(nèi)的生理功能。本研究的最主要結(jié)果如下:
　　1.由二化螟轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)獲得其堿性神經(jīng)酰胺酶saCER和中性鞘磷脂酶snSMase的基因片段序列，運用RT-PCR的方法克隆得到這兩個基因的編碼區(qū)cDNA序列。saCER開放閱讀框(ORF)大小為807bp，可編碼269個氨基酸;snSMase開放閱讀框大小為1250bp，編碼409個

3、氨基酸。序列比對發(fā)現(xiàn)saCER蛋白序列與果蠅堿性神經(jīng)酰胺酶(DaCER)具有56％的序列一致性，與人類、小鼠及酵母的堿性神經(jīng)酰胺酶蛋白序列也有較高的同源性。snSMase蛋白序列與家蠶、蝴蝶、螞蟻、赤擬谷盜等的中性鞘磷脂酶的蛋白序列分別具有70％、67％、42％和40％的同源性。此外，saCER和snSMase在sf9細胞中成功表達，Western blot檢測這兩個基因的表達產(chǎn)物分子量分別為38kD和44kD。
　　2.對saC

4、ER的生化特征的研究，得到以下結(jié)果:pSORTⅡ等程序?qū)aCER蛋白結(jié)構(gòu)、跨膜區(qū)域以及亞細胞定位的分析結(jié)果顯示，saCER存在7個潛在的跨膜區(qū)域，說明saCER可能是多跨膜區(qū)域神經(jīng)酰胺酶超家族中的一員;saCER主要定位于質(zhì)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。在sf9細胞中大量表達的saCER蛋白，在37℃下，以D-e-C24∶1 ceramide為底物，能夠明顯地表現(xiàn)出神經(jīng)酰胺酶的活性，說明saCER編碼的蛋白具有神經(jīng)酰胺酶的活性。saCER蛋白產(chǎn)物在p

5、H5.0到pH10.0的范圍內(nèi)均具有神經(jīng)酰胺酶的活性，但在pH9.0時活性最高，由此可說明saCER所編碼的蛋白確實是堿性神經(jīng)酰胺酶。
　　3.對snSMase的生化特征的研究，得到以下結(jié)果:pSORTⅡ等程序?qū)nSMase蛋白結(jié)構(gòu)、跨膜區(qū)域、亞細胞定位的分析結(jié)果顯示，snSMase只存在1個潛在的跨膜區(qū)域，主要定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和線粒體上。我們推測snSMase也是一個跨膜蛋白。在sf9細胞中大量表達的snSMase蛋白，

6、在37℃下，以C6-NBD-sphingomyelin為底物時，snSMase表現(xiàn)出來的鞘磷脂酶的活性是對照的10倍左右;在不同的pH條件下對snSMase的酶活力進行分析發(fā)現(xiàn)，它能夠適應(yīng)的pH范圍很狹窄，僅在pH7.0左右表現(xiàn)出了較高的活性，說明snSMase確實是一種中性鞘磷脂酶。
　　4.利用實時熒光定量PCR技術(shù)對saCER和snSMase生理功能的研究，得到以下結(jié)果:saCER和snSMase基因在二化螟不同發(fā)育階段及不

7、同部位都有表達。在所有的發(fā)育階段中，saCER和snSMase均在蛹期的表達量最高，且隨著二化螟從幼蟲發(fā)育到成蟲的發(fā)育進展，saCER和snSMase mRNA的表達水平也不斷升高，說明saCER和snSMase在二化螟的完全變態(tài)發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。在二化螟的不同的組織器官中，saCER在胸部和足部有最高的表達量，而snSMase在胸部和卵巢中的表達量顯著高于其它組織器官，說明saCER可能參與二化螟蛻皮激素水平的調(diào)控并且在肌肉