果蠅堿性神經(jīng)酰胺酶(DaCER)特征化及其在果蠅發(fā)育、存活和繁殖中的作用.pdf

1、神經(jīng)酰胺酶能夠水解神經(jīng)酰胺生成鞘氨醇和脂肪酸。這些鞘脂質(zhì)的代謝與多種生物(從酵母到哺乳動(dòng)物)的細(xì)胞反應(yīng)相關(guān)。通過本研究我們證明了果蠅BWA基因所編碼的蛋白具有堿性神經(jīng)酰胺酶的活性，并且這個(gè)蛋白在果蠅的鞘脂質(zhì)代謝、發(fā)育、存活和繁殖中發(fā)揮重要的作用。以下是本研究獲得的主要結(jié)果： 1.用人類神經(jīng)酰胺酶作為關(guān)鍵詞在果蠅基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast搜索，我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)由果蠅洗腦基因(brainwashing，BWA)編碼的蛋白與人類神經(jīng)酰

2、胺酶1(ACER1)、人類神經(jīng)酰胺酶2(ACER2)和人類神經(jīng)酰胺酶3(ACER3)的蛋白序列分別具有35％、46％和26％的同源性。運(yùn)用RT-PCR的方法我們克隆得到了BWA基因的全長cDNA。通過比對(duì)還發(fā)現(xiàn)，BWA編碼的蛋白與其它的堿性神經(jīng)酰胺酶也具有相同的氨基酸保守區(qū)域。用pSORTII軟件可以預(yù)測(cè)到BWA的蛋白產(chǎn)物含有5個(gè)假定的跨膜區(qū)域，推測(cè)BWA編碼的蛋白是多跨膜區(qū)域神經(jīng)酰胺酶超家族中的一員。 2.在Tn細(xì)胞中過量表達(dá)

3、BWA基因能夠在pH8.0、C24:1-ceramide作底物的條件下增加神經(jīng)酰胺酶的活性，這說明BWA編碼的蛋白具有神經(jīng)酰胺酶的活性，因此我們將BWA重新命名為果蠅堿性神經(jīng)酰胺酶(DaCER)。DaCER酶反應(yīng)最適溫度是35℃。我們還發(fā)現(xiàn)DaCER酶反應(yīng)具有更廣的pH范圍，其中最佳pH值是8.0。 3.實(shí)時(shí)定量PCR的分析結(jié)果顯示，DaCER的mRNA在果蠅卵巢中表達(dá)量最高，腦部和中腸其次，在其它部位只有少量的表達(dá)。DaCER

4、在果蠅發(fā)育過程中蛹期的表達(dá)量上調(diào)。我們構(gòu)建表達(dá)載體pEGFP-Cl-DaCER，并將它轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。熒光顯微鏡觀察的結(jié)果顯示，DaCER分布在細(xì)胞的質(zhì)膜和高爾基復(fù)合體上。 4.DaCER的功能失活導(dǎo)致果蠅未成熟期的發(fā)育延遲但是壽命和生殖力卻顯著提高，說明DaCER在果蠅的發(fā)育、壽命和繁殖中起重要的作用。 5.由轉(zhuǎn)座子插入造成的DaCER功能的失活導(dǎo)致果蠅體內(nèi)鞘氨醇和二氫鞘氨醇的水平下降，特別是C16鞘氨醇的水平顯著減

5、少。這與MAPP處理的體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相一致。經(jīng)過MAPP72h處理的S2細(xì)胞內(nèi)的C16鞘氨醇的水平也顯著的降低，表明DaCER功能的失活對(duì)鞘脂質(zhì)的代謝有改變作用。 6.為了深入研究DaCER表達(dá)的下調(diào)在體外水平上對(duì)細(xì)胞的影響，用RNAi的方法將S2細(xì)胞中DaCER的表達(dá)量下調(diào)。實(shí)時(shí)定量PCR分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了DaCER特異的雙鏈RNA的S2細(xì)胞中，DaCER的mRNA水平顯著降低，但是中性神經(jīng)酰胺酶的表達(dá)有少量升高。流式細(xì)胞儀