青蒿素類抗瘧藥與藥物代謝酶相互作用研究.pdf

1、目的：青蒿素類抗瘧藥是一類具有內(nèi)過氧橋結(jié)構(gòu)的倍半萜內(nèi)酯類化合物。已有研究表明青蒿素口服吸收迅速但不完全，多劑量給藥后的血藥濃度-時(shí)間曲線下面積明顯降低，具有自身誘導(dǎo)代謝現(xiàn)象。青蒿素類藥物自身誘導(dǎo)代謝現(xiàn)象主要與CYP2B6 (cytochromeP450, family 2, subfamily B, polypeptide 6)有關(guān)，在該酶缺乏的情況下，CYP3A4(cytochrome P450, family 3, subfamil

2、y A, polypeptide 4)也起次要代謝作用，且該類藥物還能誘導(dǎo)CYP2C19 (cytochrome P450, family 2, subfamily C, polypeptide 19)。有研究表明孤兒核受體孕烷X 受體(pregnane X receptor, PXR)及組成型雄烷受體(conatitutive androstanereceptor, CAR)是介導(dǎo)CYP450s 誘導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)控因子。青蒿素類藥物對(duì)CY

3、P450s的誘導(dǎo)是否通過激活PXR 或者CAR，目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)擬從藥物分布及代謝角度，采用熒光光譜法及同步熒光光譜法，以青蒿素類抗瘧藥的母體藥物青蒿素(artemisinin, ART)及該類衍生物共有的活性代謝產(chǎn)物雙氫青蒿素(dihydroartemisinin, DHA)為代表藥物，以牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、人血清白蛋白(human serum albumin, HAS)、大鼠肝微粒

4、體(rat liver microsomes, RLM)、人肝微粒體(human liver microsomes, HLM)、重組藥物代謝酶CYP2B6, CYP2C19, CYP3A4等為研究蛋白，從基礎(chǔ)層面研究代表藥物與蛋白的結(jié)合作用；并且進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析方法，考察青蒿素類藥物多劑量口服和靜脈注射給藥誘導(dǎo)對(duì)大鼠小腸中PXR, CAR及CYP2B, CYP3A, CYP2C 同工酶的mRNA水平的影響，據(jù)此探討青蒿素

5、類抗瘧藥對(duì)大鼠小腸CYP450s的誘導(dǎo)代謝機(jī)制。
　　 方法：(1)熒光光譜法研究青蒿素類藥物與藥物代謝酶相互作用。分別固定BSA, HAS,RLM, HLM, CYP2B6, CYP2C19及CYP3A4的濃度，逐漸加入一定體積的ART 或DHA溶液，掃描其熒光光譜及同步熒光光譜。根據(jù)Stern-Volmer 方程、結(jié)合常數(shù)表達(dá)式、熱力學(xué)方程，計(jì)算得到結(jié)合參數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)，判斷各反應(yīng)體系的熒光猝滅機(jī)制、反應(yīng)類型、主要作用力類型

6、，以及藥物對(duì)作用蛋白構(gòu)象的影響。
　　 (2) PCR 技術(shù)研究青蒿素類藥物對(duì)大鼠小腸核受體及CYP450s mRNA水平的影響。
　　 SD大鼠隨機(jī)分八組，分別進(jìn)行如下處理：ART 口服多劑量誘導(dǎo)組：80mg/kg/d；DHA 口服多劑量誘導(dǎo)組：10mg/kg/d；口服溶劑對(duì)照組：每天灌胃等體積食用油；ART 靜注多劑量誘導(dǎo)組：16 mg/kg/d；DHA 靜注多劑量誘導(dǎo)組：5 mg/kg/d；ART 靜注溶劑對(duì)照組：

7、每天靜注等體積50％乙腈；DHA 靜注溶劑對(duì)照組：每天靜注等體積50％乙醇；完全空白組。
　　 均連續(xù)給藥5天，末次給藥24h后處死大鼠，取出小腸。將小腸組織經(jīng)過Trizol 一步法提取總RNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)PXR, CAR, CYP2B1, CYP2C6及CYP3A1mRNA水平，采用2-ΔΔCt 法計(jì)算相對(duì)定量結(jié)果，SPSS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)果：(1) ART 或DHA與BSA和HAS的

8、相互作用作用均為靜態(tài)猝滅，生理體溫310K時(shí)的結(jié)合常數(shù)分別為5.54×103, 7.31×102, 1.18×103, 2.57×103L·mol-1，均為自發(fā)的熱力學(xué)反應(yīng)、作用力以氫鍵和范德華力為主，ART和DHA 均改變了BSA及HAS的構(gòu)象。
　　 (2) ART 或 DHA與RLM的相互作用均為靜態(tài)猝滅，生理體溫310K時(shí)的結(jié)合常數(shù)分別為1.90×104, 4.07×101L·mol-1; ART, DHA與HLM作用均

9、以靜態(tài)猝滅為主，生理體溫310K時(shí)，ART與HLM的結(jié)合常數(shù)在 ART濃度≤10.88×10-6mol·L-1和ART濃度≥10.88×10-6mol·L-1時(shí)，分別為1.05×104L·mol-1和1.55×105L·mol-1；DHA與HLM的結(jié)合常數(shù)為1.34×103L·mol-1；這四種反應(yīng)系統(tǒng)均為自發(fā)的熱力學(xué)反應(yīng)、作用力以氫鍵和范德華力為主。
　　 (3) ART和DHA對(duì)CYP2B6的猝滅機(jī)制以靜態(tài)猝滅為主，溫度升高

10、時(shí)則為靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅共同作用的混合猝滅機(jī)制；在生理體溫條件下DHA對(duì)CYP2B6的結(jié)合能力強(qiáng)于ART；當(dāng)溫度范圍由296K～ 303K上升到303K～ 310K，ART-CYP2B6 系統(tǒng)的主要結(jié)合力由氫鍵和范德華力轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷饔昧?，而DHA-CYP2B6 系統(tǒng)則由靜電引力轉(zhuǎn)變?yōu)闅滏I和范德華力；均為自發(fā)的熱力學(xué)反應(yīng)；在同一溫度下DHA與 ART對(duì)CYP2B6的構(gòu)象無影響。
　　 (4) ART 或DHA與CYP2C19和CY

11、P3A4的相互作用均為靜態(tài)猝滅，生理體溫310K時(shí)的結(jié)合常數(shù)分別為4.76×101, 2.43×103, 6.55×102, 5.46×103L·mol-1；這幾個(gè)反應(yīng)均為自發(fā)的熱力學(xué)反應(yīng)，并且主要結(jié)合作用力均為氫鍵和范德華力；CYP2C19及CYP3A4的同步熒光光譜則得出隨著藥物ART和DHA的不斷加入，色氨酸殘基周圍微環(huán)境親水化，而酪氨酸殘基周圍微環(huán)境則發(fā)生疏水化。
　　 (5) mRNA的測(cè)定：相比對(duì)照組及相應(yīng)的溶劑對(duì)照

12、組，多劑量口服誘導(dǎo)組和靜注誘導(dǎo)組的PXR, CAR, CYP2B6, CYP2C19, CYP3A4 mRNA水平均無顯著差異 (P>0.05)。
　　 結(jié)論：ART和DHA 均和BSA, HAS, RLM, HLM, CYP2B6, CYP2C19和 CYP3A4 有結(jié)合作用，且這兩種藥物分別對(duì)這七種蛋白產(chǎn)生的結(jié)合作用程度不同，作用力類型不盡相同，對(duì)蛋白的空間構(gòu)象影響也不同，具有種屬間差異；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)則表明，AR