青蒿素類抗瘧藥與藥物代謝酶相互作用研究.pdf

1、目的：青蒿素類抗瘧藥是一類具有內(nèi)過氧橋結構的倍半萜內(nèi)酯類化合物。已有研究表明青蒿素口服吸收迅速但不完全，多劑量給藥后的血藥濃度-時間曲線下面積明顯降低，具有自身誘導代謝現(xiàn)象。青蒿素類藥物自身誘導代謝現(xiàn)象主要與CYP2B6 (cytochromeP450, family 2, subfamily B, polypeptide 6)有關，在該酶缺乏的情況下，CYP3A4(cytochrome P450, family 3, subfamil

2、y A, polypeptide 4)也起次要代謝作用，且該類藥物還能誘導CYP2C19 (cytochrome P450, family 2, subfamily C, polypeptide 19)。有研究表明孤兒核受體孕烷X 受體(pregnane X receptor, PXR)及組成型雄烷受體(conatitutive androstanereceptor, CAR)是介導CYP450s 誘導的關鍵調(diào)控因子。青蒿素類藥物對CY

3、P450s的誘導是否通過激活PXR 或者CAR，目前尚不清楚。本實驗擬從藥物分布及代謝角度，采用熒光光譜法及同步熒光光譜法，以青蒿素類抗瘧藥的母體藥物青蒿素(artemisinin, ART)及該類衍生物共有的活性代謝產(chǎn)物雙氫青蒿素(dihydroartemisinin, DHA)為代表藥物，以牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、人血清白蛋白(human serum albumin, HAS)、大鼠肝微粒

4、體(rat liver microsomes, RLM)、人肝微粒體(human liver microsomes, HLM)、重組藥物代謝酶CYP2B6, CYP2C19, CYP3A4等為研究蛋白，從基礎層面研究代表藥物與蛋白的結合作用；并且進一步采用實時熒光定量PCR分析方法，考察青蒿素類藥物多劑量口服和靜脈注射給藥誘導對大鼠小腸中PXR, CAR及CYP2B, CYP3A, CYP2C 同工酶的mRNA水平的影響，據(jù)此探討青蒿素

5、類抗瘧藥對大鼠小腸CYP450s的誘導代謝機制。
　　 方法：(1)熒光光譜法研究青蒿素類藥物與藥物代謝酶相互作用。分別固定BSA, HAS,RLM, HLM, CYP2B6, CYP2C19及CYP3A4的濃度，逐漸加入一定體積的ART 或DHA溶液，掃描其熒光光譜及同步熒光光譜。根據(jù)Stern-Volmer 方程、結合常數(shù)表達式、熱力學方程，計算得到結合參數(shù)和熱力學參數(shù)，判斷各反應體系的熒光猝滅機制、反應類型、主要作用力類型

6、，以及藥物對作用蛋白構象的影響。
　　 (2) PCR 技術研究青蒿素類藥物對大鼠小腸核受體及CYP450s mRNA水平的影響。
　　 SD大鼠隨機分八組，分別進行如下處理：ART 口服多劑量誘導組：80mg/kg/d；DHA 口服多劑量誘導組：10mg/kg/d；口服溶劑對照組：每天灌胃等體積食用油；ART 靜注多劑量誘導組：16 mg/kg/d；DHA 靜注多劑量誘導組：5 mg/kg/d；ART 靜注溶劑對照組：

7、每天靜注等體積50％乙腈；DHA 靜注溶劑對照組：每天靜注等體積50％乙醇；完全空白組。
　　 均連續(xù)給藥5天，末次給藥24h后處死大鼠，取出小腸。將小腸組織經(jīng)過Trizol 一步法提取總RNA。采用實時熒光定量PCR 法檢測PXR, CAR, CYP2B1, CYP2C6及CYP3A1mRNA水平，采用2-ΔΔCt 法計算相對定量結果，SPSS 軟件進行統(tǒng)計分析。
　　 結果：(1) ART 或DHA與BSA和HAS的

8、相互作用作用均為靜態(tài)猝滅，生理體溫310K時的結合常數(shù)分別為5.54×103, 7.31×102, 1.18×103, 2.57×103L·mol-1，均為自發(fā)的熱力學反應、作用力以氫鍵和范德華力為主，ART和DHA 均改變了BSA及HAS的構象。
　　 (2) ART 或 DHA與RLM的相互作用均為靜態(tài)猝滅，生理體溫310K時的結合常數(shù)分別為1.90×104, 4.07×101L·mol-1; ART, DHA與HLM作用均

9、以靜態(tài)猝滅為主，生理體溫310K時，ART與HLM的結合常數(shù)在 ART濃度≤10.88×10-6mol·L-1和ART濃度≥10.88×10-6mol·L-1時，分別為1.05×104L·mol-1和1.55×105L·mol-1；DHA與HLM的結合常數(shù)為1.34×103L·mol-1；這四種反應系統(tǒng)均為自發(fā)的熱力學反應、作用力以氫鍵和范德華力為主。
　　 (3) ART和DHA對CYP2B6的猝滅機制以靜態(tài)猝滅為主，溫度升高

10、時則為靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅共同作用的混合猝滅機制；在生理體溫條件下DHA對CYP2B6的結合能力強于ART；當溫度范圍由296K～ 303K上升到303K～ 310K，ART-CYP2B6 系統(tǒng)的主要結合力由氫鍵和范德華力轉變?yōu)槭杷饔昧Γ鳧HA-CYP2B6 系統(tǒng)則由靜電引力轉變?yōu)闅滏I和范德華力；均為自發(fā)的熱力學反應；在同一溫度下DHA與 ART對CYP2B6的構象無影響。
　　 (4) ART 或DHA與CYP2C19和CY

11、P3A4的相互作用均為靜態(tài)猝滅，生理體溫310K時的結合常數(shù)分別為4.76×101, 2.43×103, 6.55×102, 5.46×103L·mol-1；這幾個反應均為自發(fā)的熱力學反應，并且主要結合作用力均為氫鍵和范德華力；CYP2C19及CYP3A4的同步熒光光譜則得出隨著藥物ART和DHA的不斷加入，色氨酸殘基周圍微環(huán)境親水化，而酪氨酸殘基周圍微環(huán)境則發(fā)生疏水化。
　　 (5) mRNA的測定：相比對照組及相應的溶劑對照

12、組，多劑量口服誘導組和靜注誘導組的PXR, CAR, CYP2B6, CYP2C19, CYP3A4 mRNA水平均無顯著差異 (P>0.05)。
　　 結論：ART和DHA 均和BSA, HAS, RLM, HLM, CYP2B6, CYP2C19和 CYP3A4 有結合作用，且這兩種藥物分別對這七種蛋白產(chǎn)生的結合作用程度不同，作用力類型不盡相同，對蛋白的空間構象影響也不同，具有種屬間差異；實時熒光定量PCR 實驗則表明，AR