產(chǎn)丁二酸基因工程菌的構(gòu)建及其厭氧發(fā)酵的初步研究.pdf

1、丁二酸，俗稱琥珀酸，作為一種常見的天然有機酸，廣泛存在于動植物和微生物中，許多厭氧微生物能夠生產(chǎn)丁二酸作為其能量代謝的主要末端產(chǎn)物。作為一種優(yōu)秀的C4平臺化合物，丁二酸可被廣泛應用于制備藥物、精細化工產(chǎn)品以及可生物降解的聚合物。傳統(tǒng)化學法合成丁二酸以不可再生資源石油為原料，成本高，環(huán)境污染嚴重，嚴重阻礙了丁二酸作為大宗化學品的發(fā)展?jié)摿ΑＩ锓ㄞD(zhuǎn)化可再生資源生產(chǎn)丁二酸，成本低，污染小，環(huán)境友好，且在發(fā)酵過程中可吸收大量CO2用于菌體的代謝

2、，具有綠色環(huán)保的優(yōu)點。
　　 本論文考察在編碼丙酮酸甲酸裂解酶基因pfl和乳酸脫氫酶基因ldh雙突變的E.coli中過量表達蘋果酸酶對其厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的影響。從E.coli DH5α基因組上通過PCR的方法擴增出編碼蘋果酸酶的基因sfcA，將其連接至pGEM-T vector上，序列測定結(jié)果與KEGG數(shù)據(jù)庫中報道的E.coli K-12蘋果酸酶基因序列一致。將擴增得到的sfcA基因，連接至載體pTrc99a上，構(gòu)建出表達載體p

3、Trc99a-sfcA，并轉(zhuǎn)化進E.coli FMJ39、DC1500、NZN111以及DC1502中，選擇0.5 mmol/L IPTG誘導劑濃度，30℃，200 rpm誘導8h后，超聲破碎細胞取上清液測定酶活力并進行SDS-PAGE分析。結(jié)果表明：測定的重組菌蘋果酸酶的比酶活在26.78～57.44 U/mg之間，比酶活比受體菌提高的倍數(shù)在87.37～161.52之間。SDS-PAGE分析的結(jié)果表明，在大約64 kDa位置上，有一明

4、顯的誘導表達條帶，與預測的sfcA分子量和文獻報道均一致。
　　 厭氧條件下考察了在上述宿主菌中過量表達蘋果酸酶對厭氧混合酸發(fā)酵途徑的影響，結(jié)果表明：除FMJ39以外，在宿主菌中過量表達蘋果酸酶，皆能夠重新恢復菌株在厭氧條件下的生長能力，丁二酸是積累的主要有機酸，且其產(chǎn)量比宿主菌有了顯著提高。其中重組NZN111的丁二酸對葡萄糖質(zhì)量收率最高，當在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加17.00 g/L初始葡萄糖時，厭氧發(fā)酵48 h后，葡萄糖完全消耗，

5、丁二酸的產(chǎn)量為8.96 g/L，丁二酸對葡萄糖的質(zhì)量收率為52.71％，其產(chǎn)酸性能在選擇的宿主菌中為最優(yōu)。重組NZN111發(fā)酵液中沒有檢測到甲酸和乳酸，有少量乙酸產(chǎn)生，丙酮酸也有部分積累。
　　 進一步對重組NZN111厭氧發(fā)酵過程中使用的誘導劑IPTG濃度，好氧與厭氧切換時機、轉(zhuǎn)接方式進行考察，結(jié)果表明：選擇IPTG終濃度為0.7 mmol/L，采用接入30 mL有氧培養(yǎng)菌泥的方式比按照10％接種量轉(zhuǎn)接對數(shù)生長期后期菌種(即O

6、D600為3.5左右)進行厭氧發(fā)酵效果要好，丁二酸的質(zhì)量收率由69.18％提高到了72.93％，且20 g/L左右的葡萄糖消耗時間由48 h降低到36 h。重組NZN111葡萄糖耐受性實驗表明：葡萄糖濃度在20-60 g/L之間時，重組NZN111菌體的生長和丁二酸產(chǎn)量都較好，丁二酸的收率隨著葡萄糖濃度的增加而增加，為73.23-78.42％之間。當葡萄糖濃度高于60 g/L時，對重組NZN111的生長和產(chǎn)酸都會有一定的抑制作用，且葡萄

7、糖濃度越高，抑制作用越明顯。5 L發(fā)酵罐上采用42.5 g/L的初始葡萄糖，發(fā)酵結(jié)束時，丁二酸對葡萄糖的質(zhì)量收率為63.07％，厭氧發(fā)酵過程中葡萄糖消耗速率為0.51g/(L·h)，丁二酸的生產(chǎn)強度為0.25 g/(L·h)。
　　 為了進一步提高丁二酸的質(zhì)量收率，研究中還選擇了NZN111的ptsG基因自發(fā)突變?nèi)笔Ь闍FP111為宿主菌，在其中過量表達蘋果酸酶，進一步提高了丁二酸的質(zhì)量收率，達到了80.88％，發(fā)酵液中沒有檢