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文檔簡介
1、本文利用含有質(zhì)粒pKD46的大腸桿菌菌株BW25113。在阿拉伯糖誘導(dǎo)后,表達入噬菌體的3個重組蛋白Gam,Bet和Exo。Gam蛋白抑制了宿主的RecBCD核酸外切酶V活性,而Bet和Exo參與了基因重組過程,因此宿主菌就具有了同源重組的能力。設(shè)計的引物5'端有39 bp的擬敲除基因的同源臂,3'端為擴增引物,以pKD3(或pKD4)為模板,擴增兩側(cè)含F(xiàn)RT位點的氯霉素(或卡那霉素抗性)基因,將此線性片段電轉(zhuǎn)入具重組功能的感受態(tài)細胞,
2、利用氯霉素(或卡那霉素抗性)平板就可以篩選到陽性轉(zhuǎn)化體。再利用表達FlP重組酶的質(zhì)粒pCP20,可將FRT位點之間的氯霉素(或卡那霉素抗性)抗性基因刪除。利用該重組系統(tǒng),構(gòu)建了乙醇脫氫酶(adhE)、D-乳酸脫氫酶(IdhA)雙缺失的大腸桿菌工程菌株BW25113D,乙酸激酶(ackA)缺失的大腸桿菌工程菌株(BW25113)。并將表達牛鏈球菌L-乳酸脫氫酶基因(IdhL)的pSE380質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BW25113D菌株中,利用SDS-PA
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