蛋白激酶A結(jié)構(gòu)、功能及抑制劑的分子模擬研究.pdf

1、蛋白激酶A(protein kinase A or cAMP-dependent protein kinase，PKA)是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，在細胞信號轉(zhuǎn)導方面扮演重要的角色。PKA全酶(R<,2>C<,2>)由調(diào)節(jié)亞基(R)與催化亞基(C)組成，被第二信使3',5’-環(huán)腺苷酸(cAMP)激活，釋放出具有活性的催化亞基。PKA的催化亞基作為激酶中代表性的結(jié)構(gòu)，是這十幾年研究的熱點。PKA對生長、分化、特定基因的表達以及糖原分解起調(diào)節(jié)

2、作用，其活性異常與許多疾病相關(guān)，是藥物設計的潛在靶點。本論文圍繞著磷酸化和結(jié)構(gòu)水對PKA催化亞基的結(jié)構(gòu)與功能的影響以及PKA催化亞基與抑制劑的結(jié)合模式進行了理論計算方面的研究。 1．PKA催化亞基活化loop(activation loop)上Thr-197的磷酸化對蛋白結(jié)構(gòu)和功能有重要的影響。為了探討磷酸化在PKA催化亞基中所起的作用，對催化亞基與ATP、Mg<'2+>復合物(C/Mg<,2>ATP復合物)和催化亞基與蛋白底

3、物多肽復合物(C/PKS復合物)分別在磷酸化和去磷酸化的狀態(tài)下進行了5納秒的分子動力學模擬。結(jié)果表明，在非磷酸化的模擬中，關(guān)鍵的磷酸化位點Thr-197所在的活化loop區(qū)柔性增加，但該loop區(qū)不會翻轉(zhuǎn)并擠占蛋白底物的結(jié)合口袋，這合理解釋了去磷酸化不影響PKA與其蛋白底物的結(jié)合速率這一實驗現(xiàn)象。C-螺旋的構(gòu)象對激酶的活性有重要的影響。在非磷酸化的模擬中，Thr-197與C-螺旋上的His-87之間不存在相互作用，導致C-螺旋偏離了原來

4、的位置，并最終改變了活性口袋ATPγ磷酸根基團的位置，這破壞了磷酸化線性轉(zhuǎn)移的方式，從而降低了非磷酸化體系中磷轉(zhuǎn)移的速率。 2．水分子對生物大分子的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、動力學性質(zhì)和功能方面有重要的影響。為了研究PKA催化亞基大葉三個結(jié)構(gòu)水分子對蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響，對催化亞基與抑制劑BD2復合物分別在含有三個結(jié)構(gòu)水和不含有三個結(jié)構(gòu)水的狀態(tài)下進行了2.5納秒的分子動力學模擬。結(jié)果表明這三個水分子分別與周圍兩個殘基形成非常穩(wěn)定的氫鍵，降

5、低了這三個結(jié)構(gòu)水周圍殘基的柔性，而且影響催化亞基與BD2的結(jié)合模式。雖然這三個水分子遠離抑制劑BD2的結(jié)合口袋，但是它們通過氫鍵網(wǎng)絡影響了活性口袋的殘基與抑制劑BD2的結(jié)合模式。在不含這三個水分子的模擬體系中，Tyr-164和Thr-183之間的氫鍵作用受到破壞，使活性口袋的Thr-183與Asp-184的構(gòu)象發(fā)生改變，從而破壞了Thr-183和Asp-184與抑制劑BD2之間的相互作用。 3．由于蛋白激酶ATP結(jié)合口袋一級序

6、列的高度同源性與三維結(jié)構(gòu)的保守性，其抑制劑的選擇性設計一直是醫(yī)藥和信號傳導研究領(lǐng)域的一個棘手的難題。為了探討抑制劑BD2對PKA和PKC高選擇性的作用機制，以PICA催化亞基與BD2復合物的晶體結(jié)構(gòu)為模板，通過同源模建與分子對接的方法構(gòu)建蛋白激酶CβⅡ(PKC βⅡ)與BD2復合物的結(jié)構(gòu)，并對這兩個復合物分別進行了2.5納秒的分子動力學模擬比較BD2與PKA、PKC βⅡ結(jié)合模式的異同，結(jié)果表明BD2與PKA形成7個氫鍵，與PKC βⅡ

7、形成了5個氫鍵，其中PKA非保守性殘基Thr-183與BD2存在氫鍵作用，但是，在PKC/BD2復合物中，與PKA的Thr-183相匹配的殘基是Ala-483，由于該殘基側(cè)鏈沒有氫鍵受體，不能與BD2形成氫鍵。BD2與PKA的疏水相互作用比其與PKC βⅡ的強，這種疏水差別主要表現(xiàn)在BD2的A環(huán)、B環(huán)。氫鍵作用和疏水作用的不同是BD2對PKA和PKC βⅡ具有高抑制選擇性的內(nèi)在因素。BD2與PKA和PKC βⅡ的相互作用模式的差異合理解

8、釋了BD2的高選擇性，這為設計高選擇性的balanol類似物抑制劑的進一步結(jié)構(gòu)修飾提供思路。 4．為了尋找3,5-二取代吡啶類化合物結(jié)構(gòu)修飾的思路，首先對抑制劑(CoMFA模板分子，化合物29)與PKA復合物進行分子動力學模擬，研究抑制劑與PKA的結(jié)合模式。然后采用CoMFA和CoMSIA方法對這類抑制劑進行三維定量構(gòu)效關(guān)系(3D-QSAR)。分子動力學模型顯示化合物29終端吡啶環(huán)的氮原子與Val-123存在氫鍵作用，中間的吡

9、啶環(huán)與Lys-72之間存在氫鍵作用，手性碳原子上質(zhì)子化的氨基與Asp-184、Asn-171存在鹽橋/氫鍵作用，這是3,5-二取代吡啶類抑制劑與蛋白激酶A/B結(jié)合模式的特征。CoMFA和CoMSIA模型有良好的預測能力，其等值線圖能很好地解釋實驗結(jié)果，可指導新的3,5-二取吡啶類化合物的設計。根據(jù)COMFA和COMSIA模型的提示，喹啉環(huán)的1位引入電正性且體積較小的取代基，在吲哚環(huán)的2位引入電負性的取代基，在吲哚環(huán)的4位的碳原子用電負性