HCV相關(guān)靶標與抑制劑相互作用的分子模擬研究.pdf

1、發(fā)現(xiàn)高效專一地抑制在丙型肝炎病毒（hepatitis C virus。HCV）生命周期中起關(guān)鍵作用的蛋白的抑制劑是抗 HCV藥物研發(fā)的重要環(huán)節(jié)。非結(jié)構(gòu)蛋白3/4A（nonsturcture protein3/4A。NS3/4A）、非結(jié)構(gòu)蛋白3解旋酶（nonsturcture protein3 helicase。NS3解旋酶）和非結(jié)構(gòu)蛋白5B（nonsturcture protein5B。NS5B）是抗HCV藥物的重要靶標，它們在 HCV

2、復(fù)制和翻譯過程中擔負著重要的角色，如對核酸的解旋和易位等。目前，一系列能夠有效地抑制這些蛋白的藥物已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，如已批準上市的針對NS3/4A的藥物波普瑞韋、特拉瑞韋和司美匹韋等。但是HCV耐藥病毒株的出現(xiàn)使得對現(xiàn)有藥物的耐藥越來越嚴重，耐藥性的產(chǎn)生嚴重影響了藥物的療效。因此尋找新穎的能夠有效地抗HCV耐藥病毒株的抑制劑迫在眉睫。隨著計算機技術(shù)的不斷進步，分子模擬方法作為尋找新型抑制劑的重要工具已被廣泛應(yīng)用于靶標與藥物的作用機制、耐藥機制

3、等研究中。如分子動力學模擬、拉伸分子動力學模擬、自適應(yīng)偏置力模擬和 Metadynamics模擬等分子模擬方法都已經(jīng)廣泛應(yīng)用于HCV相關(guān)靶標結(jié)構(gòu)和功能的研究當中。本論文將從結(jié)構(gòu)和能量的角度詳細地闡釋相關(guān)抑制劑與 HCV靶標 NS5B、NS3解旋酶和NS3/4A的相互作用機制和抑制劑的解離機制。這些實驗結(jié)果將為設(shè)計全新的抗HCV藥物提供一定的理論基礎(chǔ)。
　　本論文首先簡述了 HCV生命周期的各個階段、主要的HCV藥物作用靶標的結(jié)構(gòu)和

4、功能以及目前針對這些靶標上市或在研的藥物。并總結(jié)了分子模擬方法在HCV相關(guān)靶標與抑制劑之間的相互作用，靶標對抑制劑的耐藥機制等方面的運用情況。然后簡單介紹了本論文用到的幾種分子模擬方法：自適應(yīng)偏置力模擬、拉伸分子動力學模擬和 Metadynamics模擬等?；谶@些模擬方法，本論文的研究內(nèi)容包括4個部分。
　　論文第一部分闡釋了NS5B突變對抑制劑BMS-791325的耐藥機制。我們運用分子動力學模擬、結(jié)合自由能計算、氨基酸殘基能

5、量分解和自適應(yīng)偏置力模擬等方法探討了BMS-791325與NS5B蛋白的野生型（WT）、突變型A421V、L392I和P495L的作用機制。模擬結(jié)果表明NS5B與BMS-791325結(jié)合的關(guān)鍵作用能為疏水相互作用能，NS5B中氨基酸殘基L392、A393、A396、T399、H428、V494、P495和W500的能量貢獻值超過1 kcal/mol。BMS-791325從NS5B解離的第一步為氨基酸殘基R503與BMS-791325之間

6、的親水作用能降低，第二步為拇指區(qū)Ⅰ變構(gòu)位點與 BMS-791325之間疏水作用的消失促使 BMS-791325最終逃離NS5B。氨基酸殘基突變（A421V、L392I和P495L）導(dǎo)致BMS-791325與NS5B結(jié)合親和力和BMS-791325從NS5B解離的平均力勢降低。發(fā)生P495L之后，495位氨基酸殘基骨架環(huán)結(jié)構(gòu)消失，使其周圍的蛋白柔性增大，蛋白不能很好地錨定抑制劑。在A421V和L392I突變型NS5B體系中，突變后氨基酸殘

7、基與抑制劑之間疏水相互作用能的降低是其產(chǎn)生耐藥的主要原因。
　　論文第二部分研究了藥物索菲布韋的三磷酸活性代謝產(chǎn)物 GS-461203及底物UTP與NS5B靶標的結(jié)合與解離機制。我們從晶體結(jié)構(gòu)出發(fā)分別構(gòu)建了三元復(fù)合物 NS5B-RNA-GS-461203和 NS5B-RNA-UTP。GS-461203和 UTP分別與NS5B-RNA的分子動力學模擬結(jié)果表明：極性和非極性相互作用能對GS-461203與NS5B和UTP與NS5B的結(jié)

8、合是有利的；與UTP相比，GS-461203的2’-氟-2’-碳甲基核糖能夠與氨基酸殘基S282和I160形成很強的作用，使GS-461203能夠競爭性地結(jié)合到 NS5B-RNA結(jié)合位點中。運用隨機加速分子動力學模擬的方法預(yù)測得到UTP和GS-461203從NS5B-RNA結(jié)合位點的解離路徑是從NS5B手掌區(qū)的背面解離。通過拉伸分子動力學模擬GS-461203和UTP的解離過程發(fā)現(xiàn)，它們的解離過程大致分為3步：小分子的平移，小分子堿基和

9、核糖的翻轉(zhuǎn)和小分子與靶標完全分開。S282T對 UTP與 NS5B-RNA的結(jié)合影響較小，但是對GS-461203與NS5B-RNA結(jié)合影響較大。
　　論文第三部分研究了NS3解旋酶與其3個吲哚環(huán)類抑制劑之間的相互作用。我們運用Metadynamics模擬方法研究了抑制劑在NS3解旋酶活性口袋中的作用機制及解離過程，并構(gòu)建了抑制劑解離過程的自由能表面變化圖。抑制劑的解離過程大致分為吲哚環(huán)1位連接的疏水基團構(gòu)象發(fā)生變化之后離開疏水空

10、腔、吲哚環(huán)3位的乙羧基與NS3解旋酶之間的氫鍵斷裂和抑制劑調(diào)節(jié)到利于從NS3解旋酶結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Ⅲ之間的裂縫往外逃離的構(gòu)象而完全解離3步。該類抑制劑的吲哚環(huán)與活性口袋之間有很好的幾何匹配，3位的乙羧基能夠與氨基酸殘基G255和T269形成很強的氫鍵作用，使其構(gòu)成了吲哚環(huán)類抑制劑的基本骨架。吲哚環(huán)1位引入疏水基團能夠插入到活性口袋的疏水空腔而阻礙抑制劑的解離；吲哚環(huán)6位引入體積龐大的基團能夠增加抑制劑逃離所要克服的空間位阻。
　　論文第

11、四部分研究了NS3/4A突變對BMS-650032的耐藥機制。分子動力學模擬和結(jié)合自由能計算的結(jié)果顯示非極性相互作用能在BMS-650032與NS3/4A結(jié)合過程中起到關(guān)鍵作用。根據(jù)殘基能量分解結(jié)果定義了BMS-650032與NS3/4A相互作用的11個關(guān)鍵的氨基酸殘基。Metadynamics模擬 BMS-650032逃離NS3/4A的活性口袋表明BMS-650032的P2’和P4部分先離開疏水平面，接著P1和P1’部分逃離活性口袋，