蛋白激酶C alpha抑制劑逆轉腎癌多藥耐藥的研究.pdf

1、本文應用體外研究的方法，在PKC亞型水平探討腎細胞癌的多藥耐藥機制及逆轉，為腎細胞癌的治療提供實驗依據(jù)。 實驗分三部分： 1、采用Westem Blotting技術檢測30例腎癌組織及其周圍正常組織胞漿、胞膜中PKCα的表達。 2、采用基因工程技術構建整合有PKCα基因和綠色熒光蛋白(GFP)基因的真核表達載體，利用脂質體介導法在體外將PKCα基因導入人腎癌786-0細胞，利用熒光倒置顯微鏡、Westem Blo

2、t、RT-PCR檢測PKCα基因的表達情況；觀察PKCα激動劑Calphostin C、抑制劑PMA作用前后PKCα/786-0細胞中PKCα轉位狀態(tài)；檢測PKCαcDNA對腎癌786-0細胞的轉染前及轉染后細胞中MDR相關基因MDR1、MRP1、LRP的表達變化；采用MTT方法測定PKCα基因轉染對腎癌細胞耐藥性的影響。 3、RT-PCR觀察PKCα激動劑Calphostin C、抑制劑PMA作用前后MDR1基因表達變化；以M

3、TT法測定Calphostin C、PMA對腎癌細胞細胞生長抑制率：測定阿霉素(ADM)與PKC激動劑以及與PKC抑制劑協(xié)同作用后，786-0細胞和腎癌轉染細胞系PKCα/786-0耐藥性的變化。 研究方法： 一、實驗材料： 主要試劑：786-0人腎癌細胞系，購自中國上海細胞所細胞庫；PKCαcDNA全長開放閱讀框架(Open Reading Frame；ORF)、羧基端融合綠色熒光蛋白(C-terminal f

4、usion to Green Fluorescent ProteinP)哺乳動物細胞表達載體pcDNA-DEST47、脂質體Lipofectamine2000、Trizol試劑購自Invitrogen公司； QIAprep Miniprep Kit購自QIAGEN公司；G418：美國Gibercol BRL公司產品；用20mmol/L的HEPES稀釋成100μg/ml；0.2μm過濾器過濾除菌；保存于-20℃?zhèn)溆?；Calphos

5、tin C、ADM購自Sigama公司；PMA購自上?？党晒?；PKCα抗體購自博士德公司； M-PER Mammalian Protein Extraction Regent試劑購自PIERCE公司；第二抗體羊抗兔IgG、組蛋白Ⅲ-S、魚精蛋白均為Sigma公司產品。主要儀器：溫育箱、切片機、光學顯微鏡、高壓鍋、冰箱、顯微照相裝置、紫外/可見光光度計、低溫超速離心機、組織勻漿機、超聲粉碎機、轉印儀、搖床、電泳儀、自動電泳凝膠成像分析儀

6、、-70℃深凍冰箱、流式細胞儀、烤片機、熒光倒置顯微鏡等。 二、實驗方法： 1、腎癌組織及其周圍正常組織胞漿、胞膜中PKCα的表達。 選取2001年-2003年我院經手術切除的腎癌組織及其周圍正常組織的石蠟標本各30例，均經病理證實。男21例，女9例。年齡37歲～77歲，平均57.0歲。左側腎癌16例，右側腎癌14例。25例病例行經腹腎癌根治手術，4例行經腰腎癌根治手術，1例行經腰腎切除術。所有病例均為初發(fā)，術前

7、未行放、化療和免疫治療。病理分期參照Robson分期法，組織學分級參照Cleveland Clinic分級標準。采用Western Blot技術檢測PKCα在腎癌腫瘤組織和臨近正常組織胞漿、胞膜中的表達。 2、細胞培養(yǎng)。 細胞置于37℃，飽和濕度，含5％CO2的孵箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含有10％新生小牛血清的RPMI1640，每2-3天傳代一次，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。 3、構建pcDNA-DEST47-PKCα

8、-GFP表達載體。創(chuàng)建羧基端融合綠色熒光蛋白的pcDNA-DEST47-PKCα-GFP表達載體。 4、基因轉染786-0細胞以pcDNA-DEST47-PKCα-GFP表達載體作為目的基因，以熒光倒置顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的即時表達，觀察轉染效率。 5、PKCα/786-0細胞株的篩選建立與鑒定786-0 細胞系G418篩選試驗產生陽性克隆，收集后傳代擴增，命名為PKCα/786-0細胞株。 6、PKCα激動劑

9、、抑制劑PMA作用前后PKCα786-0細胞中PKCα轉位變化。 7、RT-PCR檢測轉染細胞轉染前后細胞內MDR1、MRP1、LRP表達。 8、MTT方法測定PKCα基因轉染對腎癌細胞耐藥性的影響。 9、RI-PCR觀察PKCα激動劑、抑制劑作用前后MDR1基因表達變化。 10、MTT法測定Calplrestin C、PMA對腎癌細胞細胞生長抑制率。 11、測定阿霉素(ADM)與PKC激動劑以及

10、與PKC抑制劑協(xié)同作用后，786-0細胞和腎癌轉染細胞系PKCα/786-0耐藥性的變化。 研究結果： 1、PKCα在腎癌腫瘤組織胞漿、胞膜中的表達與腫瘤病理分期、細胞分級相關。 2、PKCα cDNA擴增產物測序后， NCBI BLAST驗證為所需基因片斷。 3、pcDNA-DEST47-PKCα-GFP表達載體對786-0細胞的轉染：786-0細胞利用脂質體轉染pcDNA-DEST47-PKCα-GF

11、P表達載體后，未見細胞內出現(xiàn)異常顆?；蚩张莼?。24小時后熒光倒置顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的即時表達，加入G418后第2天即出現(xiàn)大量細胞死亡，第7天可見個別區(qū)域細胞呈島狀生長，細胞島處細胞呈增生象，第14天散在的細胞幾乎全部死亡(對照組細胞也全部死亡)，細胞島處細胞密度進一步增高、區(qū)域擴大。第20天時熒光倒置顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達說明pcDNA-DEST47-PKCα-GFP表達載體己轉染到786-0細胞內，該細胞命名為PKCα/78

12、6-0。熒光倒置顯微鏡證實轉基因細胞中有綠色熒光蛋白的陽性高表達。結果經Westem Blot驗證，DNA不同轉染條件均出現(xiàn)了明顯印跡，說明存在PKCα蛋白的高表達，轉染成功。RT-PCR也證實轉染后腎癌細胞中存在PKCα基因的高表達。 4、PKCα/786-0細胞株中，PKCα主要位于胞漿，呈彌漫分布，核周表達極少處于未激活狀態(tài)。熒光顯微鏡檢測激活/抑制狀態(tài)下PKCα-GFP的分布結果發(fā)現(xiàn)：抑制劑PMA處理后，PKCα從胞漿內

13、，迅速分布到核內和核膜處，胞漿內幾乎無表達，細胞進入激活狀態(tài)。而加入Calphostin C處理后，PKCα的分布與未786-0細胞相似，PKCα有重新歸位于胞漿，核周熒光表達少，從而進入抑制狀態(tài)。激活/抑制PKCα狀態(tài)下，胞漿和胞膜均發(fā)生PKCα-GFP的轉位。 5、KCα與MDR相關基因的RT-PCR結果，經FluorChem凝膠分析系統(tǒng)分析。MDR1在PKCα/786-0表達中增加，而MRPl和LRP在轉染前后差異不大，表

14、明腎癌轉染細胞系PKCα/786-0的MDR1表達水平高于腎癌786-0細胞。 6、786-0細胞對ADM的IC<,50>為7.8015e<'-7>(5.7046e<'-7>～1.0669e<'-6>)；PKCα/786-0對ADM的IC<,50>為1.6588e<'-6>(1.1621e<'-6>～2.3677e<'-6>)。PKC激動劑PMA聯(lián)合ADM處理PKCα/786-0的IC<,50>為2.6794e<'-6>(2.0

15、521e<-6>～3.4983e<'-6>)；PKC抑制劑CalphostinC聯(lián)合ADM處理PKCa/786-0的IC<,50>為9.2506e<'-8>(5.9337e<'-8>～1.4422<'e-7>)。 7、Calphostin C、PMA作用后MDR1基因表達分別出現(xiàn)升高和降低。 研究結論： 1、KC-α在腎癌腫瘤組織中存在膜轉位；PKCα在腎癌發(fā)生發(fā)展過程中可能起了重要的調控作用。 2、PK

16、Cα在腎癌組織胞膜中高表達，在腎癌組織胞漿中低表達，并且與腎癌的病理分期和細胞分級密切相關。 3、PKCα基因可被成功轉染入人腎癌細胞并穩(wěn)定表達。 4、PKC在胞膜與胞液中均有分布，與其活性狀態(tài)有關。持續(xù)的PKC激活，可能在細胞增殖、分化及腫瘤發(fā)生等方面起著重要的作用。PKCα特異抑制劑Calphostin C通過抑制PKCα的膜轉位使人腎癌細胞處于失活狀態(tài)，不能對相應底物產生相關作用。 5、蛋白激酶C-cDNA