蛋白激酶A錨定蛋白Cypher在心臟中的功能及機(jī)制研究.pdf

1、1.目的和意義：
　　蛋白激酶A又稱cAMP依賴型蛋白激酶A(cyclic-AMP dependent protein kinaseA)，在細(xì)胞信號調(diào)控中發(fā)揮重要功能，參與生物體糖原及脂類代謝的調(diào)控。在心肌細(xì)胞中，PKA的磷酸化作用對心肌收縮、代謝、離子流、基因表達(dá)等生理過程的調(diào)節(jié)十分重要。蛋白激酶A全酶由兩個催化亞基（C亞基）和兩個調(diào)節(jié)亞基(R亞基)組成，全酶在cAMP低水平時，以異源四聚體形式存在。腎上腺素受體活化增加細(xì)胞中的

2、cAMP的含量，cAMP與調(diào)節(jié)亞基結(jié)合，改變調(diào)節(jié)亞基構(gòu)象，使調(diào)節(jié)亞基和催化亞基解離，釋放出催化亞基。活化的蛋白激酶A催化亞基可使細(xì)胞內(nèi)某些蛋白的絲氨酸或蘇氨酸殘基磷酸化，進(jìn)而發(fā)揮相關(guān)的生物學(xué)功能。
　　PKA發(fā)揮精細(xì)調(diào)控功能依賴于PKA錨定蛋白(A-kinase anchoring protein，AKAP)，通過它將PKA與其底物聚集到特定的亞細(xì)胞區(qū)域，從而提高了磷酸化修飾的特異性以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的準(zhǔn)確性，有效地整合cAMP信號通路

3、中的上游活化因子和下游效應(yīng)蛋白。目前在心臟中發(fā)現(xiàn)20多個AKAPs，它們組成一個調(diào)控網(wǎng)絡(luò)共同調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的生理功能。PKA介導(dǎo)的Tropolin I，Myosin binding proteinC(MyBP-C)，Titin和Myosin light chain蛋白磷酸化和心肌細(xì)胞的收縮密切相關(guān)，目前心肌肌小節(jié)上發(fā)現(xiàn)的AKAPs有:Synemin、cTnT、Myospryn和Myomegalin，但具體的調(diào)控機(jī)制還未研究清楚。
　

4、　Cypher基因（人的對應(yīng)基因為ZASP）又稱LDB3，其編碼蛋白Cypher是PDZ-LIM結(jié)構(gòu)域蛋白家族中的一員，主要在橫紋肌中表達(dá)，位于肌小節(jié)的Z線上。心肌細(xì)胞定向敲除Cypher的小鼠發(fā)生了嚴(yán)重的擴(kuò)張型心肌病(DCM)和心源性猝死。ZASP基因突變與心肌病、骨骼肌病相關(guān)，到目前為止ZASP基因中共發(fā)現(xiàn)16個突變位點，然而突變造成不同類型肌病的分子病理機(jī)制仍然不清楚。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Cypher的蛋白二級結(jié)構(gòu)中存在兩性螺旋

5、，提示Cypher可能和PKA調(diào)節(jié)亞基結(jié)合。由此我們推測:Cypher不僅僅作為骨架蛋白，參與心肌的收縮，而且它還參與了PKA信號在心肌細(xì)胞中的調(diào)控作用。揭示Cypher與PKA的關(guān)系將有助于拓寬我們對于心肌病發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識，并為心肌病的治療引入潛在的新靶點。
　　2.研究方法：
　　首先采用生物信息學(xué)方法分析Cypher的二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)存在兩性螺旋。為了驗證此結(jié)果我們體外過表達(dá)帶標(biāo)簽的蛋白，然后用標(biāo)簽抗體親和純化的方法鑒定

6、相互作用的蛋白及參與的氨基酸殘基。同樣的方法也用來驗證Cypher和鈣調(diào)磷酸酶(CaN)和L型鈣通道(LTCC)的相互作用。采用體外PKA磷酸化與突變的方法相結(jié)合，確定了Cypher與LTCC上可能的PKA作用位點。在體內(nèi)，利用Cypher敲除小鼠研究了Cypher敲除對LTCC，PKA蛋白表達(dá)的影響，以及腎上腺素刺激下野生型小鼠與Cypher敲除小鼠中LTCC的PKA磷酸化水平的差異。最后利用免疫共沉淀和酶活試劑盒檢測CaN的酶活。<

7、br>　　3.研究結(jié)果：
　　3.1 Cypher1c、2c、CCSR都能和PKA調(diào)節(jié)亞基RⅡα結(jié)合;兩性螺旋結(jié)構(gòu)域中的氨基酸突變后與PKA調(diào)節(jié)亞基RⅡα的結(jié)合顯著降低;同時Cypher結(jié)合于PKA調(diào)節(jié)亞基RⅡα中的D/D結(jié)構(gòu)域。
　　3.2 ZASP/Cypher中與心肌病相關(guān)的T206I突變體與PKA調(diào)節(jié)亞基RⅡα的結(jié)合作用增強(qiáng)。
　　3.3 Cypher中265和296兩個位點的Ser突變成Ala顯著降低PKA對

8、Cypher的磷酸化水平。
　　3.4 Cypher依賴PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合于L型鈣離子通道的C端，在HEK293細(xì)胞和心肌細(xì)胞中Cypher都可以增強(qiáng)PKA對L型鈣離子通道的磷酸化作用，并且該調(diào)節(jié)作用是依賴于Cypher的PDZ結(jié)構(gòu)域。β腎上腺素受體活化后，Cypher敲除小鼠中L型鈣離子通道的PKA磷酸化水平明顯低于野生型小鼠。
　　3.5 Cypher能夠與Calcineurin結(jié)合，并結(jié)合區(qū)位于Calcineurin的酶

9、催化活性區(qū)。與野生型小鼠相比，Cypher敲除小鼠中Calcineurin的酶活性顯著增強(qiáng)。
　　4.結(jié)論：
　　4.1 Cypher是一個典型的Ⅱ型AKAP，Cypher與PKA調(diào)節(jié)亞基結(jié)合是基于Cypher的兩性螺旋結(jié)構(gòu)域，Cypher結(jié)合于PKA調(diào)節(jié)亞基的D/D結(jié)構(gòu)域。病理性點突變T206I的分子機(jī)制可能是增強(qiáng)了ZASP/Cypher與PKA調(diào)節(jié)亞基的結(jié)合。
　　4.2 Cypher是PKA的底物，Cypher中