犬下頜牽張成骨、新生犬與成年犬的骨組織mRNA表達譜差異分析.pdf

1、目的:研究牽張成骨區(qū)骨組織、新生幼犬骨組織與成年犬骨組織的基因表達差異情況，從而找到牽張成骨期間可能激活的與新生發(fā)育期成血管及成骨有關(guān)的因子及信號通路。使驗證臨床牽張成骨的成骨速度是嬰幼兒骨生長發(fā)育速度的4-6倍的原因成為可能。
　　方法:1.將6只犬隨機分成牽張成骨固定0周組及對照組（未作處理成年犬）。牽張成骨固定0周組行單線DO牽張手術(shù)，于手術(shù)后1周開始牽張，每天1mm，牽張1周，于牽張結(jié)束當天處死動物并收集標本，對照組直接處

2、死動物并收集標本。另選取新生半小時內(nèi)幼犬3只作為新生組，處死動物并收集標本。利用大體觀、CBCT技術(shù)、HE染色法觀察標本。
　　2.提取三組標本總RNA，建立cDNA文庫，用Hiseq4000平臺對上述三組進行高通量測序。對測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量評估、序列比對分析，基因表達水平分析;檢測差異基因表達情況并對差異基因進行GO富集，以此對其功能富集情況進行了解。
　　結(jié)果:所有實驗動物均順利完成手術(shù)及術(shù)后的牽張過程。術(shù)后無動物死亡現(xiàn)象

3、，傷口愈合良好，無感染等不良情況，未發(fā)現(xiàn)牽張器松脫、斷裂現(xiàn)象，固定良好。
　　1.大體觀:DO-0組:牽張區(qū)域內(nèi)未見新骨形成，由肉芽組織充填，質(zhì)地較軟。
　　2.CBCT觀察:牽張區(qū)未見白色阻射影，無新骨形成，缺隙兩側(cè)邊界清晰。
　　3.RNA樣品質(zhì)量檢測:RNA條帶清晰，無雜質(zhì)污染，完整性較好，降解率低。
　　4.HE染色: DO-0組:牽張間隙內(nèi)為肉芽組織，鏡下見大量毛細血管增生。兩側(cè)骨段端見新生骨小梁和骨基

4、質(zhì)，骨小梁較細小，骨基質(zhì)周緣有大量成骨細胞但排列不規(guī)則。P-0組:骨小梁較幼稚、細小，骨基質(zhì)周圍有成骨細胞，鏡下見大量毛細血管增生。Normal組:骨小梁粗大，成骨細胞明顯減少。膠原纖維粗大并可見成熟的哈弗氏系統(tǒng)。
　　5.測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估:(1) A/T/G/C堿基含量分布統(tǒng)計:三個樣本文庫堿基分布均勻，N％在合理范圍之內(nèi)。(2)堿基質(zhì)量分布統(tǒng)計:所獲得測序數(shù)據(jù)達到后續(xù)分析要求。(3)堿基錯誤率分布統(tǒng)計:錯誤率均小于0.1％。<

5、br>　　6.序列比對結(jié)果:Normal組比對率是57.06％; DO-0組比對率是52.55％;P-0組比對率是47.37％。三個樣品的比對率尚可，可以進行后續(xù)分析。
　　7.隨機性評估:reads在基因各部分分布符合中間深兩端低的布局，說明基因片段打斷隨機性好，測序數(shù)據(jù)結(jié)果可進行后續(xù)的生物信息學(xué)分析。
　　8.差異表達基因檢測結(jié)果:在Normal組與P-0組、DO-0組的對比中找到253個顯著性差異表達基因，其中表達下調(diào)

6、的有175個，表達上調(diào)的有78個。
　　9.GO富集分析結(jié)果:對Normal組與P-0、DO-0組對比表達上調(diào)的差異基因進行GO富集分析，其中與細胞代謝相關(guān)的基因高表達。對Normal組與DO-0組對比中表達上調(diào)的差異基因進行GO富集分析，發(fā)現(xiàn)與細胞的增殖、遷移，血管形成、生長發(fā)育等相關(guān)的基因高表達。
　　結(jié)論:發(fā)現(xiàn)DO-0組、P-0組與Normal組的差異表達基因有253個，其中上調(diào)的有78個，下調(diào)的有175個，且在上調(diào)的