用植物葉綠體為生物反應器表達重要外源蛋白的研究.pdf

1、用植物為生物反應器生產外源重組蛋白已成為生物技術研究的新領域。在植物中表達外源重組蛋白具有遺傳操作簡單、生產成本低、無動物病毒和細菌毒素污染等優(yōu)點。近幾年發(fā)展起來的植物葉綠體轉化技術可使外源基因定向導入葉綠體基因組中并實現表達。葉綠體遺傳轉化與傳統(tǒng)的核轉化相比具有許多優(yōu)點，如高效表達外源基因；通過同源重組定點整合方式導入外源基因消除了位置效應及基因沉默；能同時進行多基因表達；母系遺傳方式可防止外源基因通過花粉擴散等。因此，利用植物葉綠體

2、為生物反應器生產動物口服疫苗、細胞生長因子及工農業(yè)酶制劑成為生物工程領域研究的熱點。衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是單細胞植物，素有“綠色酵母”(green yeast)之稱，其含有一個單一約占整個細胞體積40％的大型杯狀葉綠體，且與質膜緊貼，使外源基因的轉化和轉化后的同質化過程較為容易。因此，衣藻葉綠體是表達外源蛋白質的理想材料。 TRAIL(tumor necrosis factor-relate

3、d apoptosis inducing ligand)，亦稱Apo-2L，是新發(fā)現的又一腫瘤壞死因子超家族成員，它能選擇性誘導多種腫瘤細胞凋亡而對正常細胞無毒性，這一特點顯示TRAIL是一種新的抗腫瘤藥物，在腫瘤治療中有著潛在的、廣泛應用前景。我們選擇衣藻葉綠體基因組 clpP-trnL-petB-chlL-rpl23-rpl2為同源重組片段，壯觀霉素抗性基因為選擇標記，構建了編碼TRAIL胞外區(qū)可溶性片段(sTRAIL)的cDNA衣

4、藻葉綠體表達載體p64TRAIL，通過基因槍將其導入衣藻葉綠體中，經壯觀霉素抗性篩選，獲得了3個抗性衣藻轉化子。轉化子經過抗性繼代篩選后，經PCR、Southern blot檢測分析及暗培養(yǎng)，證實sTRAIL編碼區(qū)DNA整合到衣藻葉綠體基因組中，Westernblot檢測分析表明sTRAIL編碼區(qū)在衣藻葉綠體中獲得了表達。Western blot影像攝錄分析表明，表達的sTRAIL蛋白占衣藻細胞可溶性總蛋白的0.43％-0.67％。實驗

5、結果證明用衣藻葉綠體為生物反應器生產醫(yī)藥蛋白是可行的。 來源于 Pyrococcus．furiosus的耐高溫α-淀粉酶是一種重要的酒精工業(yè)用酶，在植物中表達耐高溫α-淀粉酶可以大大降低用植物秸稈生產酒精的成本。 本實驗室構建了來源于Prococcus.furiosus的耐高溫α-淀粉酶基因的衣藻葉綠體表達載體p64A。通過基因槍將其導入衣藻葉綠體中，經壯觀霉素抗性(100mg/L)篩選，獲得了9個抗性衣藻轉化子。轉化子

6、經過抗性繼代篩選后，經PCR、Southern blot檢測分析及暗培養(yǎng)，證明耐高溫α-淀粉酶基因整合到衣藻葉綠體基因組中并得到表達。酶活性檢測表明，轉基因衣藻表達產物具有耐高溫α-淀粉酶活性，最高達77.5U/g鮮重衣藻。用植物為生物反應器生產動物口服疫苗是一條安全、有效、廉價的動物疫苗生產新途徑。營養(yǎng)豐富，適口性好的豆科牧草是表達植物性動物食用疫苗的首選受體植物，表達的疫苗無須提取純化，可以直接食用免疫。口蹄疫(Foot and M

7、outh Disease，FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄目動物強烈傳染病。口蹄疫病毒表面主要保護性抗原基因VP1編碼的囊膜糖蛋白可誘導機體產生中和抗體，保護動物免受病毒侵襲。為了開辟生產口蹄疫疫苗的新途徑，我們構建了兩種口蹄疫病毒主要保護性抗原基因VP1與強黏膜免疫佐劑霍亂毒素B亞基(CTB)的融合基因CTBVP1在優(yōu)良豆科牧草百脈根葉綠體基因組中定點整合表達載體。通過對百脈根葉綠體基因組的分析，選擇合適的外源基因在其中的

8、整合位點，并設計引物用PCR 方法擴增了兩對葉綠體基因組同源片段psbA、trnK和rbcL、atpB，構建百脈根特異的葉綠體轉化通用載體pAK和pLB；選擇葉綠體基因特異的強啟動子Prrn和終止子TpsbA為調控序列，構建了包含CTBVP1融合基因表達盒和aadA壯觀霉素抗性基因表達盒的百脈根葉綠體定點整合載體pAKCV和pLBCV；經PCR和酶切驗證，所構建的轉化載體符合預期設計。百脈根葉綠體轉化載體的合理構建為百脈根葉綠體的轉化及