基于piggyBac轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因家蠶絲腺生物反應器表達外源蛋白的研究.pdf

1、家蠶是既是理想模式生物，又是重要的經(jīng)濟昆蟲。應用轉(zhuǎn)基因家蠶絲腺生物反應器表達外源蛋白有著廣闊的前景。
　　 本文選擇了狂犬病病毒核蛋白(RVNP)、狂犬病病毒糖蛋白(RVGP)和人溶菌酶蛋白(hLYZ)作為外源基因，再連接到家蠶絲腺特異性啟動子后，成功構建了轉(zhuǎn)基因載體，通過顯微注射法導入家蠶早期卵中，并分析其整合情況及外源基因的表達情況。
　　 本研究構建A3啟動子驅(qū)動EGFP報告基因和Ser1啟動子驅(qū)動狂犬病病毒N基因

2、的piggyBac表達載體(pBSer1RVNP-A3EGFP)，利用昆蟲卵可視化自吸式外源基因?qū)敕▽爰倚Q的早期卵中，依靠EGFP報告基因檢測轉(zhuǎn)基因家蠶陽性個體，獲得了26種在中部絲腺細胞中特異表達N蛋白基因的個體。提取轉(zhuǎn)基因家蠶G2代基因組DNA，用PCR法檢測RVNP基因，結果顯示RVNP基因已整合進家蠶的染色體。抽提轉(zhuǎn)N蛋白基因的轉(zhuǎn)基因家蠶蠶繭中的蛋白質(zhì)，用SDS-PAGE和Western blot法證實NP蛋白在轉(zhuǎn)基因家蠶絲

3、腺中特異的表達，重組NP蛋白的分子量為63KD，與理論值相符。
　　 本研究還構建兩個轉(zhuǎn)基因載體：pBSer1GP-A3EGFP載體和pBF1c-LRVGP-A3EGFP載體。pBSer1RVGP-A3EGFP載體是由A3啟動子驅(qū)動EGFP報告基因和Ser1啟動子驅(qū)動狂犬病病毒G基因的piggyBac表達載體；pBFlcRVGP-A3EGFP載體是由A3啟動子驅(qū)動EGFP報告基因和Flc-L啟動子驅(qū)動狂犬病病毒G基因的piggy

4、Bac表達載體。利用昆蟲卵可視化自吸式外源基因?qū)敕▽爰倚Q的早期卵中，依靠EGFP報告基因檢測轉(zhuǎn)基因家蠶陽性個體，獲得的陽性個體分別為3種和5種。提取轉(zhuǎn)基因家蠶G2代基因組DNA，用PCR法檢測RVGP基因，結果顯示RVGP基因已整合進家蠶的染色體。抽提轉(zhuǎn)G蛋白基因的轉(zhuǎn)基因家蠶蠶繭中的蛋白質(zhì)，用SDS-PAGE證實GP蛋自在轉(zhuǎn)基因家蠶絲腺中特異的表達，重組GP蛋白的分子量為71.5KD，與理論值相符。
　　 本研究還構建了以A