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1、家蠶這種模式生物以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),一直備受科學(xué)界的青睞。轉(zhuǎn)基因技術(shù)日趨成熟完善,為利用家蠶生物反應(yīng)器表達(dá)外源珍貴蛋白提供了條件。PiggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)具有低毒、可承載大片段的外源基因以及精確轉(zhuǎn)座,不留下轉(zhuǎn)座印跡的特點(diǎn),被廣泛的應(yīng)用到多種生物的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)中。但常規(guī)的研究中,由于PiggyBac載體多數(shù)含有兩個(gè)表達(dá)框,具有較多的元件和相同的酶切位點(diǎn),所以,每次表達(dá)不同的外源基因時(shí),需要從頭構(gòu)建質(zhì)粒,組裝啟動(dòng)子、信號(hào)肽、外源基因、polyA等
2、結(jié)構(gòu),構(gòu)建質(zhì)粒的過(guò)程費(fèi)時(shí)費(fèi)力,降低轉(zhuǎn)基因的工作效率。除此之外,雖然許多研究者利用家蠶生物反應(yīng)器表達(dá)外源蛋白,縱觀這些研究成果,我們發(fā)現(xiàn)外源蛋白的表達(dá)量較低,沒(méi)有達(dá)到預(yù)期的效果。本研究針對(duì)該現(xiàn)狀,主要從三方面解決上述問(wèn)題。
針對(duì)構(gòu)建donor質(zhì)粒工作繁瑣的問(wèn)題,本研究構(gòu)建了三種通用型質(zhì)粒,以PiggyBac轉(zhuǎn)座子為基礎(chǔ)并帶有Amp抗性基因,包括PiggyBac轉(zhuǎn)座子的兩個(gè)轉(zhuǎn)座臂PiggyBacL和PiggyBacR,以及兩個(gè)轉(zhuǎn)座
3、臂之間的兩個(gè)表達(dá)框,一個(gè)功能表達(dá)框是A3啟動(dòng)子啟動(dòng)的綠色熒光蛋白基因表達(dá)框,即A3 Promoter-EGFP-SV40,第二個(gè)包括絲素輕鏈基因啟動(dòng)子或絲膠基因啟動(dòng)子、絲素蛋白輕鏈基因信號(hào)肽、六聚組氨酸、腸激酶酶切位點(diǎn)和家蠶絲素蛋白輕鏈基因3'末端的表達(dá)框。DDDDK與絲素輕鏈基因polyA之間含有ApaⅠ和NheⅠ專一性的兩個(gè)酶切位點(diǎn),用以切開質(zhì)粒,插入目的外源基因,形成完整的donor質(zhì)粒。本發(fā)明的質(zhì)粒能夠只經(jīng)一次酶切連接就完成表達(dá)
4、各種外源基因donor質(zhì)粒的構(gòu)建,減少了每次從頭構(gòu)建donor質(zhì)粒的工作量,提高家蠶中后部絲腺生物反應(yīng)器工作效率。
針對(duì)外源蛋白表達(dá)量低的問(wèn)題,本研究通過(guò)在Serl promoter后增加18s rRNA啟動(dòng)子,構(gòu)成雙啟動(dòng)子表達(dá)外源蛋白的模式。通過(guò)熒光定量PCR和Western blot比較分析,我們發(fā)現(xiàn)含有雙啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因家蠶品種T4 Ligase基因的平均表達(dá)量SL的1.2倍,雙啟動(dòng)子可以提高外源基因的表達(dá)。
不
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