大腸桿菌O157：H7糖綴合物疫苗的生物法合成及免疫學(xué)研究.pdf

1、大腸桿菌(E.coli) O157∶H7是嚴(yán)重的腸道致病菌，通常引起腹瀉、出血性結(jié)腸炎、溶血性尿毒癥等。傳統(tǒng)的抗生素治療會引起腸道內(nèi)E.coliO157∶H7細(xì)胞裂解并向腸道黏膜釋放志賀樣毒素等，有加重病情的風(fēng)險。疫苗作為替代手段，對預(yù)防E.coli O157∶H7的感染具有重要意義。
　　O-抗原或O-PS，作為脂多糖的重要組成部分，暴露在細(xì)菌外表面，是機(jī)體免疫系統(tǒng)識別的重要靶點。O-PS是不依賴于T細(xì)胞的抗原。O-PS免疫機(jī)體

2、主要產(chǎn)生抗O-PS的IgM抗體，幾乎不產(chǎn)生IgG抗體以及T細(xì)胞記憶，需要按期重復(fù)接種來維持免疫力，并且不能在免疫系統(tǒng)發(fā)育不完全的小于2周歲的嬰幼兒、免疫力低下的老年人等人群中產(chǎn)生足夠的免疫力。通過將O-PS連接到載體蛋白上，形成的糖綴合物是依賴于T細(xì)胞的抗原。糖綴合物免疫機(jī)體產(chǎn)生的抗O-PS抗體從IgM向IgG、IgA等轉(zhuǎn)換，并產(chǎn)生T細(xì)胞記憶，不僅能在健康成年人體內(nèi)產(chǎn)生持久的免疫力，而且針對嬰幼兒、免疫力底下的老年人同樣有效。
　

3、　糖綴合物疫苗，公認(rèn)為是最有效和最安全的抗菌疫苗之一。為了有效預(yù)防E.coli O157∶H7的感染，本論文針對E.coli O157∶H7的O-PS進(jìn)行了糖綴合物疫苗的生物法合成及免疫學(xué)研究。
　　本論文分為三部分研究內(nèi)容。第一部分是生物法合成糖綴合物疫苗（第二章）;第二部分是糖綴合物疫苗O-PS-MBP的免疫學(xué)評價（第三章）;第三部分是載體蛋白及其不同位置多肽對糖綴合物疫苗抗多糖IgG滴度和亞型的影響（第四章）。
　　第

4、一部分:
　　糖綴合物疫苗的合成通常采用化學(xué)法。但是化學(xué)法存在著生產(chǎn)成本高、質(zhì)量難以控制、容易有批次間的差異等局限性。本部分我們采用基于空腸彎曲菌(C.jejuni)N-糖基化系統(tǒng)的體內(nèi)酶法合成糖綴合物疫苗。糖基轉(zhuǎn)移酶PglB是C.jejuni的關(guān)鍵酶，負(fù)責(zé)將糖鏈從類萜類脂載體連接到載體蛋白的氨基酸序列D/E-X-N-Y-S/T(X，Y≠P)的天冬酰胺(N)殘基上。利用來自C.jejuni的N-糖基化系統(tǒng)和E.coli O-PS合

5、成途徑比較相似的特點，將C.jejuni N-糖基化系統(tǒng)的關(guān)鍵酶PglB的基因、E.coliO157∶H7O-PS合成基因、載體蛋白（麥芽糖結(jié)合蛋白MBP、CRM197或AcrA）合成基因?qū)氲角贸腔D(zhuǎn)移酶基因waal的宿主菌E.coliW3110中，從而建立E.coli的N-糖基化系統(tǒng)。利用E.coli N-糖基化系統(tǒng)生產(chǎn)糖綴合物疫苗，具有構(gòu)建方式靈活、一次發(fā)酵、純化條件簡單、成本低的特點，滿足大規(guī)模制備的要求。同時，利用E.col

6、i N-糖基化系統(tǒng)生產(chǎn)的糖綴合物疫苗糖基化位點、糖鏈長度等明確并可控，且生產(chǎn)批次之間沒有差異，滿足作為疫苗的質(zhì)量要求。
　　然后通過對重組菌的誘導(dǎo)、蛋白的表達(dá)和純化，得到的糖綴合物經(jīng)過定性分析（包括考馬斯亮藍(lán)染色檢測、western blot檢測、MALDI-TOF檢測、糖組成分析），得到了3個連有E.coli O157∶H7O-PS的、載體蛋白不同的糖綴合物O-PS-MBP、O-PS-CRM、O-PS-AcrA。又通過定量分析得

7、知，O-PS-MBP、O-PS-CRM、O-PS-AcrA的得率約為0.5～1 mg/L（蛋白定量），且O-PS-MBP和O-PS-CRM的糖基化比例比O-PS-AcrA更高。利用E.coli N-糖基化系統(tǒng)生產(chǎn)糖綴合物O-PS-MBP、O-PS-CRM、O-PS-AcrA，開辟了一條合成E.coli O157∶H7疫苗的新途徑，具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　第二部分:
　　適應(yīng)性免疫應(yīng)答分為體液免疫和細(xì)胞免疫。之前報道的抗E.

8、coli O157∶H7的糖綴合物疫苗O-PS-rEPA和O-PS-Stx，更多關(guān)注的是其產(chǎn)生抗E.coli O157∶H7多糖抗體的能力，即體液免疫。幾乎沒有文獻(xiàn)報道糖綴合物疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生的細(xì)胞免疫，包括T細(xì)胞的增殖和分化、細(xì)胞因子的分泌等?，F(xiàn)在，有越來越多的研究表明細(xì)胞免疫在抗菌感染的重要作用，而且其作用時間比抗體更加持久。
　　目前的嬰幼兒計劃免疫中有很多疫苗是糖綴合物疫苗。然而，同時或先后免疫接種多種糖綴合物疫苗時，如果

9、載體蛋白相同，可能會引起免疫抑制等負(fù)面作用。面對日益增多的新型的糖綴合物疫苗，除了廣泛應(yīng)用的載體蛋白外，急需尋找和開發(fā)新的載體蛋白。目前，探索新型載體蛋白主要集中在尋找含有T細(xì)胞表位的蛋白、有Toll樣受體特性的蛋白等。最近，人們開始關(guān)注MBP在免疫學(xué)上的價值和應(yīng)用。一些具有抗腫瘤、抗菌或抗寄生蟲的活性蛋白在和MBP融合表達(dá)后活性明顯提高。研究證明MBP有TLR4激動劑的性質(zhì)，可促進(jìn)Th1細(xì)胞的活化，并有激活樹突狀細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞、促

10、進(jìn)脾臟淋巴細(xì)胞的增殖等作用。然而，目前還沒有文獻(xiàn)報道MBP作為糖綴合物疫苗的載體蛋白以及MBP對糖綴合物疫苗的免疫增強(qiáng)作用。
　　本部分，我們用以MBP作為載體蛋白的糖綴合物O-PS-MBP免疫BALB/c小鼠，檢測O-PS-MBP激活的體液免疫和細(xì)胞免疫。體液免疫方面，O-PS-MBP激活小鼠產(chǎn)生了抗E.coliO157∶H7多糖的血清IgG、IgM和腸道IgA。并且，O-PS-MBP免疫血清在補體環(huán)境中可以有效殺死E.coli

11、 O157∶H7。細(xì)胞免疫方面，O-PS-MBP促進(jìn)脾臟淋巴CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞的增殖。此外通過分析得出，O-PS-MBP免疫血清中IFN-γ、抗E.coli O157∶H7多糖IgG2a含量較高，說明O-PS-MBP刺激小鼠機(jī)體偏向Th1型免疫應(yīng)答。進(jìn)一步地，通過ELISPOT分析發(fā)現(xiàn)，MBP無論是單獨免疫還是以糖綴合物的形式免疫，都能刺激機(jī)體產(chǎn)生IFN-γ，抑制產(chǎn)生IL-4,說明載體蛋白MBP使O-PS-MBP偏向Th1型

12、細(xì)胞免疫應(yīng)答，有很好的免疫增強(qiáng)作用。以MBP作為糖綴合物疫苗的載體蛋白具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　第三部分:
　　糖綴合物疫苗激活機(jī)體產(chǎn)生抗多糖抗體，并通過多糖抗體介導(dǎo)的調(diào)理素或補體作用吞噬病菌，達(dá)到清除病菌、保護(hù)機(jī)體的作用。糖綴合物疫苗產(chǎn)生的抗多糖IgG抗體是體液免疫應(yīng)答的重要組成部分，IgG抗體滴度的高低直接決定著糖綴合物疫苗的免疫效果。IgG根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點，可分為不同的亞型，包括IgG1、IgG2、IgG3等。不同的Ig

13、G亞型有不同的功能和特點。同時，IgG亞型分布反應(yīng)了Th細(xì)胞免疫應(yīng)答的方向（Th1或Th2）。研究糖綴合物疫苗引起的IgG亞型的分布或Th細(xì)胞分化的方向，對評價糖綴合物疫苗免疫機(jī)制和效果有重要意義。
　　本部分，我們通過多肽免疫小鼠實驗和不同載體蛋白的糖綴合物疫苗免疫小鼠實驗，探討了載體蛋白及其不同位置多肽對糖綴合物疫苗抗多糖IgG滴度和亞型的影響。
　　首先是載體蛋白及其不同位置多肽對糖綴合物疫苗抗多糖IgG滴度的影響。通

14、過ELISA檢測3個載體蛋白不同的糖綴合物疫苗O-PS-MBP、O-PS-CRM、O-PS-AcrA分別免疫小鼠后的血清，結(jié)果發(fā)現(xiàn)載體蛋白不同的糖綴合物疫苗產(chǎn)生的抗多糖IgG滴度不同。此外，有文獻(xiàn)報道，載體蛋白對糖綴合物疫苗抗多糖抗體有促進(jìn)和抑制作用。然而，臨床結(jié)果沒有規(guī)律可循，也沒有明確的機(jī)制去解釋這種現(xiàn)象。通過以載體蛋白MBP上3個不同位置的多肽分別前免疫，以O(shè)-PS-MBP后免疫，檢測多肽對O-PS-MBP抗多糖抗體的促進(jìn)或抑制作

15、用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)載體蛋白MBP中靠近糖基化位點或者糖基化位點處的多肽，相比遠(yuǎn)離糖基化位點的多肽，對糖綴合物疫苗O-PS-MBP產(chǎn)生抗E.coli O157∶H7多糖IgG有明顯促進(jìn)作用。因此，載體蛋白的促進(jìn)或抑制作用和糖綴合物疫苗的糖基化位點的多少有密切關(guān)系。后免疫的糖綴合物疫苗的糖基化位點越多，靠近糖基化位點的或糖基化位點處的多肽就越多，越會發(fā)生促進(jìn)現(xiàn)象;相反，糖基化位點越少，靠近糖基化位點的或糖基化位點處的多肽就越少，越會發(fā)生抑制現(xiàn)象。

16、
　　其次是檢測載體蛋白及其不同位置多肽對糖綴合物疫苗抗多糖抗體IgG亞型的影響。盡管糖綴合物疫苗的抗多糖IgG亞型分布與抗載體蛋白IgG亞型分布不一致，但是通過比較MBP和O-PS-MBP免疫血清中抗不同位置多肽的IgG亞型發(fā)現(xiàn)，與MBP相比，O-PS-MBP抗靠近糖基化位點的或糖基化位點處的多肽的IgG2a顯著降低，而免疫O-PS-MBP產(chǎn)生的抗多糖抗體以IgG2a為主。由于靠近糖基化位點的或糖基化位點處的多肽包含有糖綴合物降

17、解形成的寡糖-多肽中的部分多肽，由此，我們可以推斷得出，寡糖-多肽中的抗多肽的IgG亞型分布和抗寡糖的IgG亞型分布是一致的。
　　綜上所述，寡糖-多肽的多肽可促進(jìn)糖綴合物疫苗中抗多糖抗體IgG的產(chǎn)生，并且影響抗多糖抗體的IgG亞型分布。因此，通過改變糖綴合物疫苗的糖基化位點的個數(shù)或改變糖基化位點的位置，可控制糖綴合物疫苗抗多糖IgG的滴度和亞型分布。
　　總之，本論文通過建立E.coli N-糖基化系統(tǒng)為生產(chǎn)糖綴合物疫苗開