腸出血性大腸桿菌O157∶H7緊密素克隆表達(dá)及其免疫原性分析.pdf

1、1.腸出血性大腸桿菌O157: H7緊密素部分基因片段的克隆與表達(dá)
　　 參照GenBank中EHEC O157: H7（參考株EDL933）的緊密素基因序列設(shè)計一對特異性引物，用PCR方法擴(kuò)增緊密素部分編碼基因eae，得到2266bp片段，然后克隆到pMD18-T載體中，T-A克隆后構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-eae，經(jīng)測序鑒定后轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)， ITPG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE檢測，并進(jìn)行表

2、達(dá)形式的鑒定，PAGE鑒定獲得82kD目的蛋白，超聲破菌后電泳證實目的蛋白以包涵體形式表達(dá)。包涵體復(fù)性后目的蛋白純化效果明顯，純化后純度可達(dá)90％以上。目的基因高效表達(dá)，經(jīng)Westem Blot鑒定該蛋白能被陽性血清所識別，具有良好的免疫原性。
　　 2.腸出血性大腸桿菌O157: H7緊密素蛋白對BALB/c小鼠免疫保護(hù)作用試驗
　　 本實驗選用BALB/c小鼠作為研究EHEC O157: H7感染的動物模型，通過皮下

3、免疫途徑對EHEC O157: H7的緊密素蛋白進(jìn)行小鼠免疫保護(hù)作用實驗研究。每兩周免疫一次，共3次。分別于免疫2、3次后的10天斷尾采血，ELISA檢測血清特異性抗體效價。三免后第7天用致死劑量的O157全菌(1.2×1010CFU)經(jīng)口灌胃感染小鼠。結(jié)果表明，免疫3次后抗體水平有明顯的升高。小鼠免疫保護(hù)試驗結(jié)果顯示保護(hù)率達(dá)到80％。免疫后攻菌實驗顯示疫苗抗原具有較強(qiáng)的保護(hù)作用，在新型亞單位疫苗研制中具有應(yīng)用價值。
　　 3.

4、緊密素重組蛋白抗血清對腸出血性大腸桿菌粘附HEp-2細(xì)胞的抑制試驗
　　 表達(dá)緊密素重組蛋白，進(jìn)一步分析其相關(guān)生物學(xué)功能，分別進(jìn)行了HEp-2細(xì)胞的粘附試驗和粘附抑制試驗。結(jié)果顯示腸出血性大腸桿菌EDL933株可以粘附HEp-2細(xì)胞。用重組表達(dá)的緊密素蛋白免疫動物抗血清處理EDL933，能部分抑制其對HEp-2細(xì)胞的粘附。試驗證明抗緊密素抗體可以抑制此類細(xì)菌在動物體內(nèi)腸道定居。為進(jìn)一步研究緊密素(intimin)重組蛋白的生物學(xué)