環(huán)介導等溫擴增技術快速檢測肉類中的大腸桿菌O157︰H7的研究.pdf

1、國內(nèi)外檢測E.coli O157:H7的方法很多，我國進出口食品對E.coli O157:H7目前采用的方法是以行業(yè)標準SNT0973-2010作為依據(jù)。通過對樣品增菌處理后，進行平板劃線，然后挑取可疑菌落進行形態(tài)、染色及血清學試驗、生化鑒定等進行判定。檢測過程耗時長達4～7天，難以適應快速檢驗的要求。本研究針對E.coli O157:H7,GenBank: S83460.1編碼O157抗原的rfbE基因序列和GenBank:AF228

2、487.1編碼鞭毛H7特異性抗原的fliC基因序列，運用在線引物設計軟件(https://primerexplorer.jp/lamp3.0.0/index.html)設計LAMP引物。對反應時間、反應溫度、鎂離子濃度等擴增條件進行了優(yōu)化。確定25μL的LAMP反應體系是：內(nèi)引物（FIP和BIP）各1.6μm，外引物（F3和B3）各0.2μm，環(huán)引物（LF和LB）各0.8μm，2.5 mmol/L dNTP，4 mmol/L MgSO4

3、，10×Bst DNA聚合酶反應緩沖液，8U的Bst DNA聚合酶大片段，3μLDNA模板和用滅菌雙蒸水補足體系。確定LAMP反應過程是首先在63℃水浴鍋中反應20min，然后將其放入80℃水浴鍋中，水浴10min終止反應，通過肉眼觀察有無白色焦磷酸鎂沉淀。此外，取擴增產(chǎn)物進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳，觀察梯形條帶，以證實是否發(fā)生了LAMP反應。改良LAMP檢測E.coli O157:H7的純培養(yǎng)物的靈敏度達到1.4CFU/mL。和人工污

4、染檢出限達到1.8CFU/g。
　　比較了6種模板制備方法對LAMP檢測肉及肉制品中E.coli O157:H7的影響。研究表明LAMP方法對制備模板DNA的要求不高。采用熱裂解法提取DNA，不僅提取時間將大大減少，而且也將大大降低檢測成本。對187份實際樣品同時進行改良LAMP檢測和依據(jù)SNT0973-2010進行常規(guī)檢測，結(jié)果證明，兩種方法符合率達到99.47%。
　　研究表明LAMP快速檢測E.coli O157:H7