胡黃連苷Ⅱ?qū)毙阅摱拘愿螕p傷小鼠的保護及機制研究.pdf

1、研究目的
　　膿毒癥所致的多臟器功能衰竭(MOF)，在危重癥醫(yī)學領(lǐng)域仍是危害人類健康的重大難題，而膿毒性肝損傷目前在臨床上病死率一直居高不下。因此亟待探索其發(fā)病機制和有效的治療藥物以改善預后。胡黃連苷Ⅱ(PicrosideⅡ，PicⅡ)的抗炎、抗細胞凋亡等藥理作用目前已得到公認，而對膿毒性肝損傷研究甚少。本課題擬通過腹腔注射脂多糖/D-氨基半乳糖苷(LPS/D-GalN)構(gòu)建經(jīng)典的急性肝損傷(ALI)動物模型，采用熒光定量PCR、

2、流式細胞術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附實驗等實驗技術(shù)，觀察胡黃連苷Ⅱ?qū)毙阅摱拘愿螕p傷的保護作用;體外實驗探討胡黃連苷Ⅱ抗細胞凋亡、焦亡的作用機制。
　　研究方法
　　1.胡黃連苷Ⅱ?qū)PS/D-GalN誘導的小鼠急性膿毒性肝損傷的影響
　　(1)C57BL/6雄性小鼠40只，隨機分為生理鹽水(NS)組，ALI組、ALI+ PicⅡ組、PicⅡ組，每組10只。ALI+ PicⅡ組及PicⅡ組分別于LPS/D-GalN注射前24h，1

3、2h，6h，1h四個時間點腹腔注射20mg/kg胡黃連苷Ⅱ，NS組和ALI組同時間同劑量腹腔注射NS;接下來ALI+ PicⅡ組與ALI組腹腔注射LPS10μg/只和D-GalN800mg/kg，NS組和PicⅡ組腹腔注射等劑量的NS，觀察造模后16h內(nèi)小鼠生存率。
　　(2) C57BL/6雄性小鼠12只，分為上述4組，每組3只。處理同上，于造模后5h眼球靜脈采血，頸脫臼處死小鼠。分別檢測血清炎癥因子TNF-α、IL-6，ALT

4、、AST水平;觀察各組小鼠肝組織大體形態(tài)，肝HE染色，檢測肝組織TNF-α、IL-6mRNA表達水平，綜合評價各組肝功能狀態(tài)。提取各組剩余肝組織的肝細胞，流式細胞術(shù)(FCM)檢測AnnexinⅤ-PE，caspase-1-FITC，7AAD的熒光強度變化;羅丹明123檢測線粒體膜電位變化;Western Blot檢測caspase-3活化水平，pro-caspase-1，caspase-1(p20)蛋白的表達。
　　2.胡黃連苷Ⅱ

5、抗凋亡、焦亡的作用機制
　　(1)提取C57BL/6雄性小鼠腹腔巨噬細胞，分為對照組（A組），胡黃連苷Ⅱ組(B組)，LPS組（C組），LPS+胡黃連苷Ⅱ組（D組）。Western Blot檢測pJNK、Bcl-2/Bax表達，探索PicⅡ抗細胞凋亡的分子機制。
　　(2)提取C57BL/6雄性小鼠腹腔巨噬細胞，分為對照組（E組），胡黃連苷Ⅱ組口組），LPS+ATP組（G組），LPS+ATP+胡黃連苷Ⅱ組（H組）。ELISA檢

6、測上清IL-1β、IL-18水平;Western Blot檢測pro-caspase-1，caspase-1(p20)，NLRP3、ASC變化，探索PicⅡ抗細胞焦亡的分子機制。
　　研究結(jié)果
　　1.與NS組相比，ALI組小鼠16h生存率明顯下降，ALI+ PicⅡ組較ALI組升高。血清TNF-α、IL-6，ALT、AST含量，肝組織TNF-α、IL-6 mRNA在ALI組表達顯著升高(P＜0.05); ALI+ PicⅡ

7、組上述各指標比ALI組下降(P＜0.05)，ALI+ PicⅡ組比PicⅡ組高(P＜0.05）。
　　2.肝臟外觀:ALI組肝臟腫大，被膜緊張，明顯淤血和出血，而ALI+ PicⅡ組僅為輕度淤血。肝臟病理切片經(jīng)HE染色顯示ALI組肝細胞壞死，大量炎癥細胞浸潤和充血，ALI+ PicⅡ組則表現(xiàn)為輕度的病理改變。肝細胞經(jīng)AnnexinⅤ/7AAD染色后，ALI組肝細胞凋亡率明顯高于NS組(P＜0.05)，ALI+ PicⅡ組較ALI組

8、凋亡率下降（P＜0.05）。羅丹明123染色顯示ALI組陽性率明顯高于NS組(P＜0.05)，ALI+ PicⅡ組陽性率低于PicⅡ組（P＜0.05）。經(jīng)caspase-1/7AAD染色結(jié)果顯示:ALI組肝細胞的焦亡率明顯高于NS組(P＜0.05)，ALI+PicⅡ組較ALI組下降，但高于PicⅡ組(P＜0.05)。四組pro-caspase-3表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05），ALI組活化的caspase-3明顯高于NS組(P＜0

9、.05），ALI+ PicⅡ組高于PicⅡ組（P＜0.05）;各組pro-caspase-1表達含量無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。ALI組活化的caspase-1表達明顯高于NS組(P＜0.05)，ALI+ PicⅡ組高于PicⅡ組(P＜0.05)。
　　3.體外細胞實驗:細胞凋亡模型經(jīng)胡黃連苷Ⅱ干預后顯示:B組p-JNK明顯高于A組，C組比B組下降，C組比D組表達增高(P＜0.05）;B組Bcl-2/Bax明顯低于A組，C組比B

10、組升高，C組比D組表達增高(p＜0.05);細胞焦亡模型經(jīng)胡黃連苷Ⅱ干預后顯示:F組細胞上清IL-1β、IL-18濃度明顯高于E組(P＜0.05），G組低于F組(P＜0.05)。Western Blot檢測NLRP3，ASC，caspase-1(p20)變化:F組明顯高于E組(P＜0.05），G組比F組下降(P＜0.05)，G組比H組高(P＜0.05)。
　　結(jié)論
　　1.胡黃連苷Ⅱ抑制LPS/D-GalN誘導的小鼠肝損傷的