度他雄胺對大鼠附睪精子成熟和生育影響的實驗研究和機制探討.pdf

1、目的： 研究度他雄胺對大鼠附睪精子成熟和生育的影響，探討度他雄胺抗雄性生育可能的作用機制，探索調(diào)節(jié)雄性生育的睪丸后作用靶點，初步建立附睪相關(guān)調(diào)節(jié)生育基因表達譜數(shù)據(jù)庫。 方法： 1．使用度他雄胺20和40mg/kg/d大鼠灌胃給藥，同時以氯丙二醇10mg/kg/d作為參照組，連續(xù)2周。給藥結(jié)束后雄鼠與處于動情前期的雌鼠按2:1合籠，計算雌鼠的交配指數(shù)、受孕指數(shù)和生育指數(shù)，直接評價雄鼠生育力；采用計算機輔助精子分析系

2、統(tǒng)分析大鼠附睪精子活力和形態(tài)，在此基礎上合并使用透射電鏡技術(shù)對各組附睪尾部精子進行透射電鏡分析，評價度他雄胺對大鼠精子成熟的影響；采用SYBR-14和propidium iodide(PI)雙重熒光染色計算精子存活率；采用Elisa法測定大鼠睪酮(testosterone,T)和雙氫睪酮(dihydrotestosterone,DHT)血清濃度，評價度他雄胺對雄鼠雄激素水平的影響；采用精密電子天平對各組睪丸、附睪、前列腺和精囊進行稱重，

3、評價度他雄胺對大鼠生殖器官重量的影響；采用HE染色法對各組睪丸和附睪進行組織學分析，同時采用透射電鏡技術(shù)對附睪上皮細胞超微結(jié)構(gòu)進行分析，評價度他雄胺對大鼠主要生殖器官組織學的影響。 2．采用差異貼壁分離、不銹鋼過濾網(wǎng)過濾和添加DHT相結(jié)合的方法，進行大鼠附睪上皮細胞的原代分離培養(yǎng)；使用CCK-8試劑盒測定附睪上皮細胞的增殖活性，繪制細胞的生長曲線；使用角蛋白和波形蛋白抗體對附睪上皮細胞進行免疫細胞染色，以鑒定附睪上皮培養(yǎng)細胞的純

4、度。 3．通過度他雄胺體外作用于附睪上皮細胞，采用不同給藥濃度和作用時間，評價了度他雄胺對離體大鼠附睪上皮細胞活性的作用。具體使用Cell CountingKit-8(CCK-8)檢測了不同藥物濃度和作用時間下，附睪上皮細胞增殖活性的改變，通過測定光密度和抑制率，計算度他雄胺對附睪上皮細胞體外作用的IC<,50>；在此基礎上使用硫代巴比妥酸和4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷法測定了度他雄胺對附睪上皮細胞分泌蛋白唾液酸和α-1，4

5、糖苷酶活性的影響；使用透射電鏡對藥物作用后附睪上皮細胞的超微結(jié)構(gòu)進行分析，評價度他雄胺對體外附睪上皮細胞形態(tài)功能的影響。 4．使用Afrymetix Genome Rat 230 2.0 Oligo-microarray對度他雄胺組、氯丙二醇組與正常大鼠附睪基因表達差異進行研究。具體采用Trizol對每組3個附睪(共9個)RNA分別進行抽提，并使用紫外定量與變性凝膠電泳質(zhì)檢，然后將各組RNA樣本充分混合并純化；使用Affymet

6、rix one-cycle cDNA Synthesis Kit和Affymetrix GeneChip Sample Cleanup Module進行eDNA合成與純化；使用GeneChip IVT Labeling Kit和Genechip Sample Cleanup Module進行cRNA的合成、生物素標記和純化；cRNA定量檢測后，對其進行片段化處理(大小35-200bp)；接著在Genechip hybridization

7、 oven 640進行芯片雜交，16小時；洗脫、染色后，將芯片放入GeneChip Scanner 3000進行掃描，使用GeneChipoperating software(GCOS)對掃描圖像進行處理分析。各芯片探針信號經(jīng)整體歸一化(Global Normalization)后進行比較，根據(jù)信號表達強弱篩選出差異基因。使用Genespring GX 7.3.1和Fatigo+對差異基因進行進一步的功能分類。使用實時定量RT-PCR對

8、部分差異基因進行驗證，綜合評價度他雄胺和氯丙二醇對大鼠附睪基因表達的影響。 結(jié)果： 1.度他雄胺低高劑量組血清DHT水平較陰性對照組(3.28nmol/L)均明顯降低(P<0.01)，分別為0.54和0.28nmol/L(P<0.01)，而氯丙二醇組(3.13nmol/L)較陰性對照組則無顯著差異(P>0.05)；相應地，度他雄胺低高劑量組精子活率較陰性對照組(71.2％)亦明顯降低，分別為39.0％和28.7％(P<0

9、.01)，存活率下降為23.9％和21.5％(P<0.05)，畸形率分別增加為10.3％和15.6％(P<0.05)，最后受孕指數(shù)分別降為62.5％和38.4％，生育指數(shù)降為56.3％和31.3％，平均胎仔數(shù)降為8.7和6.2個(P<0.05或0.01)。同時睪酮水平和交配指數(shù)均無明顯變化(P>0.05)，HE染色提示睪丸和附睪亦無明顯病理學改變；進一步的透射電鏡分析表明度他雄胺高劑量組相當部分附睪上皮細胞有核染色質(zhì)聚集和大量空泡形成，

10、提示附睪上皮細胞有凋亡前兆。 2.本實驗共分離培養(yǎng)附睪上皮細胞13次，培養(yǎng)成功9次，培養(yǎng)成功率為69.2％；接著附睪上皮原代細胞共傳代9次，成功5次，傳代成功率為55.6％；最后對附睪上皮細胞進行的免疫細胞染色結(jié)果為附睪上皮細胞角蛋白染色胞漿呈棕色，波形蛋白染色陰性，純度達95％以上，可以用于體外功能研究。 3.度他雄胺對體外附睪上皮細胞的增殖活性和形態(tài)功能可產(chǎn)生影響，其中與附睪上皮細胞共培養(yǎng)48h時，度他雄胺的IC<,

11、50>為16.1μg/ml，提示其具有較強的抑制附睪上皮細胞活性的作用；體外附睪功能蛋白活性測定顯示度他雄胺可以抑制唾液酸的活性；進一步的透射電鏡顯示附睪上皮細胞有凋亡前兆，這與體內(nèi)實驗結(jié)果相吻合。 4.使用Affymetix Rat Genome array 230 2.0芯片對度他雄胺高劑量組和正常對照組大鼠附睪基因表達差異進行了研究，在全基因組31042個轉(zhuǎn)錄子(transcripts orprobe sets)中，根據(jù)d

12、etection p-value<0.04為“Present”，正常對照組附睪共檢測到17031個，占總數(shù)的54.8％，而度他雄胺組附睪共檢測到18251個，占總數(shù)的58.7％。在此基礎上根據(jù)GCOS data mining、GeneSpring和Fatigo+分析：相對于正常組，度他雄胺組附睪轉(zhuǎn)錄子表達顯著變化的有1996個，占附睪轉(zhuǎn)錄子表達總數(shù)的10.9％，其中下調(diào)950個(Change p-value>0.997)，上調(diào)1046個

13、(Changep-value<0.0025)，差異基因主要涉及大分子的代謝和轉(zhuǎn)運、細胞信息交流、防御反應、受體活性、離子結(jié)合、細胞凋亡、水解酶和轉(zhuǎn)移酶活性等基因。在進一步的差異基因功能分析中，篩選到度他雄胺下調(diào)的甾體激素代謝相關(guān)基因，它們的功能異常引起相關(guān)脂肪、蛋白和糖代謝的異常，進而可能引起附睪微環(huán)境的改變和精子成熟異常。另外度他雄胺組還篩選到較多上調(diào)的細胞凋亡正調(diào)控基因和下調(diào)的負調(diào)控基因，與前面度他雄胺在體和離體實驗影響附睪形態(tài)功能

14、的結(jié)果相一致，這可能是其抑制生育的一個重要原因。同時，在全基因組31099個轉(zhuǎn)錄子中，氯丙二醇組附睪共檢測到17410個，占總數(shù)的56.0％相對于正常組，氯丙二醇組附睪基因表達顯著變化的有169個，其中下調(diào)基因79個，上調(diào)基因90個，差異基因主要涉及大分子的代謝和轉(zhuǎn)運、初級代謝過程、細胞代謝、生物學過程調(diào)控、免疫學調(diào)控、離子結(jié)合、水解酶和氧化還原酶活性等基因。進一步的差異基因功能分析發(fā)現(xiàn)氯丙二醇可以下調(diào)糖、脂肪、蛋白等物質(zhì)和能量代謝基因

15、，這與其傳統(tǒng)抗生育理論相一致。 結(jié)論： 1.附睪尾部精子活力與度他雄胺對：DHT的抑制水平之間存在相關(guān)性，即抑制水平越高，附睪尾部精子活力越低，進而雄鼠生育力也隨之降低。度他雄胺通過抑制DHT水平，影響附睪精子成熟(活力和形態(tài))而阻止精卵結(jié)合，最后達到抑制生育作用。同時度他雄胺組睪丸的各級精細胞梯度變化和組織學檢查無異常，說明藥物對睪丸精子和結(jié)構(gòu)無影響。除此之外，本實驗還發(fā)現(xiàn)度他雄胺高劑量組可以誘導部分附睪上皮細胞凋亡，

16、這可能是由于附睪上皮細胞增殖高度依賴于DHT引起的，度他雄胺抑制DHT水平后，上皮細胞因缺少DHT調(diào)控而出現(xiàn)增殖抑制和凋亡前兆，進而影響其分泌吸收活性，導致附睪管微環(huán)境的改變，最后影響附睪精子成熟，這與度他雄胺誘導前列腺細胞凋亡治療前列腺增生和前列腺癌的作用機理非常相似。 2．雖然對大鼠附睪上皮細胞成功進行了分離純化和原代培養(yǎng)，但由于整個操作過程的復雜性、間質(zhì)細胞的干擾性、貼壁分離的不確定性和細胞傳代的有限系性，所以重復性較低，

17、使原代附睪上皮細胞的體外藥物篩選和研究遇到一定的限制。希望今后可以結(jié)合使用其它方法如滲透性支持培養(yǎng)等進行更多的嘗試，以找到附睪上皮細胞原代培養(yǎng)更好的方法。 3．在附睪上皮細胞原代培養(yǎng)成功的基礎上，研究了度他雄胺對體外附睪上皮細胞活性和形態(tài)功能的影響，結(jié)果表明度他雄胺對其活性有較強的抑制作用；對附睪功能標志蛋白唾液酸活性的影響，則提示其可能通過影響附睪分泌蛋白和精子成熟；另外藥物作用后的上皮細胞出現(xiàn)凋亡前兆，說明在保證上皮細胞各細