氟他胺誘導大鼠干眼模型的實驗研究.pdf

1、本研究擬通過制作雄激素受體拈抗劑氟他胺誘導的大鼠干眼模型，觀察大鼠淚液分泌量、淚膜穩(wěn)定性、眼表組織病理學變化;通過免疫組織化學方法檢測腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細胞介素-1α(interleukin-1α，IL-1α)在角膜、結膜、淚腺和瞼板腺上皮的表達，探討雄激素受體拮抗劑氟他胺導致干眼的發(fā)病機制，分析該模型的科學性及實用性，并為干眼的治療提供理論依據。
　　第一部分 氟他

2、胺誘導大鼠干眼模型的建立
　　目的：
　　建立雄激素受體拮抗劑氟他胺誘導的大鼠干眼動物模型，為進一步探討雄激素在干眼發(fā)病機制中的作用提供基礎。
　　方法：
　　清潔級健康成年SD雌性大鼠32只，采用隨機數字表法分為高濃度組、中濃度組、低濃度組和對照組，每組各8只。高、中、低濃度組分別用濃度為16mg·kg-1·d-1、13mg·kg-1·d-1、10 mg·kg。1·d-1氟他胺溶液灌胃，對照組1ml·d-1生理

3、鹽水灌胃，每組分別于給藥前和給藥后2、4、8、16、20周測干眼臨床指標:淚液分泌試驗(SchirmerⅠ test，SⅠt)、淚膜破裂時間(tear firm break-up time，BUT)及角膜熒光素鈉染色評分。造模成功標準:給藥后20周時高、中、低濃度組大鼠的干眼臨床指標與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義。每組分別于給藥前、給藥后10、20周行心臟穿刺取血，采用放射免疫法測量血清睪酮及雌二醇濃度。使用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件數

4、據分析，描述性統(tǒng)計值用(X)+S表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1.SchirmerⅠ test:給藥后4周時高濃度組(8.20±0.58mm)、中濃度組(8.53±0.34mm)SⅠ t值開始減少，與對照組(9.84±0.54mm)比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);8周時高濃度組(7.13±0.25mm)、中濃度組(7.04±0.47mm)、低濃度組(8.43±0.67mm)的SⅠt值均少于對照

5、組(9.94±0.43mm)(P＜0.05);隨著時間延長，20周時高濃度組(3.23±0.31 mm)、中濃度組(3.98±0.36mm)、低濃度組(4.73±0.18mm)的SⅠt值進一步減少，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，且均較對照組(9.60±0.60mm)下降大于50％(P＜0.05)。
　　2.BUT:給藥后4周時高濃度組(6.80±1.05s)大鼠即出現(xiàn)BUT縮短，分別與低濃度組(8.63±0.65s)

6、、對照組(9.25±1.03s)比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);8周時，高濃度組(5.20±0.58s)、中濃度組(7.21±0.56s)、低濃度組(8.32±0.37s)的BUT兩兩比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，且均短于對照組(10.70±1.07s)(P＜0.05);20周時高(2.40±0.61s)、中(4.32±0.68s)、低(6.10±0.81s)濃度組的BUT較對照組(9.12±0.73s)進一步縮短，各

7、組之間兩兩比較差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。
　　3.角膜熒光素鈉染色:給藥后4周時高、中濃度組開始出現(xiàn)角膜上皮點狀熒光素鈉著色;8周時角膜熒光素鈉染色評分高濃度組(6.80±0.79)、中濃度組(4.13±0.53)分別與低濃度組(2.50±1.08)、對照組(0.56±1.30)比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);16周時高濃度組可見彌漫性大片狀著色，中、低濃度組角膜上皮出現(xiàn)小片狀著色，隨時間延長高、中、低濃度組角

8、膜熒光素鈉染色評分逐漸加重，20周時高濃度組(9.05±0.49)、中濃度組(7.21±0.57)、低濃度組(4.82±0.47)、對照組(1.05±1.13)染色評分兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　4.性激素水平:給藥后10周時高濃度組（4.38±0.68pg·ml-1）、中濃度組（3.56±0.53pg·ml-1）的血清睪酮濃度開始升高，分別與對照組比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.05);20周時高濃度組（

9、5.08±0.21pg·ml-1）、中濃度組（4.23±0.16pg·ml-1）、低濃度組（3.58±0.24pg·ml-1）血清睪酮濃度較對照組(2.24±0.15pg·ml-l)不同程度升高，兩兩比較差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。給藥后10、20周時高、中、低濃度組血清雌二醇濃度較對照組均無明顯差異(P＞0.05)，各組之間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　結論：
　　雄激素受體拮抗劑氟他胺溶液灌胃可以

10、成功建立混合型干眼模型，且干眼的嚴重程度呈時間和藥物濃度依賴性。
　　第二部分 氟他胺誘導大鼠干眼模型的機制研究
　　目的：
　　探討氟他胺誘導大鼠干眼模型的作用機制。
　　方法：
　　實驗動物及分組同第一部分。20周后麻醉下處死各組動物，取角膜、結膜、淚腺和瞼板腺組織HE染色觀察各上皮病理組織變化，并采用免疫組織化學方法檢測TNF-α、IL-1α在各組織上皮的表達。每張切片選取5個200倍視野進行拍照，并

11、用Image-Pro Plus分析軟件對照片進行陽性細胞計數，使用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件數據分析，描述性統(tǒng)計值用X±S表示，TNF-α、IL-1α的表達量用單因素方差分析（One-Way ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1.角膜組織病理學觀察:高、中、低濃度組角膜出現(xiàn)不同程度鱗狀上皮層次明顯增加，排列紊亂且可見表層細胞不規(guī)則缺失，翼狀細胞及基底細胞排列紊亂，基質層水腫，高濃度組病變最顯著。

12、對照組角膜上皮細胞層次正常較扁平，表層細胞不角化，翼狀上皮細胞呈多角形，基底細胞排列整齊。
　　2.淚腺組織病理學觀察:高、中、低濃度組出現(xiàn)不同程度淚腺上皮細胞扁平萎縮小而密集、胞漿淡染，可見空泡，細胞排列紊亂，腺腔擴大。腺泡萎縮融合，大小不一，結構排列紊亂，高濃度組改變最為顯著。對照組可見結締組織深入實質將腺組織分割成小葉，邊界清晰而規(guī)則的腺泡細胞大小均勻，內層是柱狀上皮細胞，核位于基底部。
　　3.結膜組織病理學觀察:高

13、、中、低濃度組出現(xiàn)不同程度結膜上皮細胞層數增多，層次間模糊，排列紊亂呈角化狀，基底層細胞排列不整齊，可見炎性細胞浸潤。對照組結膜上皮細胞排列規(guī)則，無角化及炎性細胞浸潤。
　　4.瞼板腺組織病理學觀察:高、中、低濃度組出現(xiàn)不同程度瞼板腺腺體萎縮融合，鱗狀上皮化生，腺管壁增厚，基底細胞變薄，腺管周圍纖維化和腺管開口擴張。對照組瞼板腺可見邊界清晰而規(guī)則的腺細胞，大小均勻排列整齊，腺管呈一同心圓狀，管壁厚度正常。
　　6.角膜中TN

14、F-α、IL-1α的表達:免疫組化結果顯示高、中、低濃度組TNF-α、IL-1α大量表達于角膜上皮細胞胞漿及少量表達于基質層，對照組微量表達。高、中、低濃度組每1000個角膜上皮細胞中TNF-α、IL-1α陽性表達的細胞數明顯高于對照組(P＜0.05)。高、中濃度組角膜上皮TNF-α、IL-1α的陽性細胞數相對低濃度組較高(P＜0.05)。
　　7.淚腺中TNF-α、IL-1α的表達:免疫組化結果顯示高、中濃度組TNF-α、IL-

15、1α大量表達于淚腺腺泡上皮細胞胞漿，低濃度組可見中量表達，對照組少量表達。高、中、低濃度組每1000個淚腺細胞中TNF-α、IL-1α陽性表達的細胞數明顯高于對照組(P＜0.05）。高、中濃度組淚腺上皮TNF-α的陽性細胞數相對低濃度組較高（P＜0.05），但高、中濃度組間比較，差異無顯著統(tǒng)計學意義（P＞0.01）。高、中、低濃度組的IL-1α陽性細胞計數組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　8.瞼板腺中TNF-α、

16、IL-1α的表達:免疫組化結果顯示高、中、低濃度組TNF-α、IL-1α大量表達于瞼板腺腺泡細胞胞漿，對照組少量表達。高、中、低濃度組每1000個瞼板腺腺泡細胞中TNF-α、IL-1α陽性表達的細胞數明顯高于對照組(P＜0.05）。高、中濃度組TNF-α、IL-1α的陽性細胞計數相對低濃度組較高(P＜0.05)，但高、中濃度組間比較，差異無顯著統(tǒng)計學意義(P＞0.01)。
　　9.結膜中TNF-α、IL-1α的表達:免疫組化結果顯

17、示高、中、低濃度組TNF-α、IL-1α大量表達于結膜上皮細胞胞漿，微量表達于固有層，對照組少量表達于結膜上皮細胞胞漿。高、中、低濃度組每1000個結膜上皮細胞中TNF-α、IL-1α陽性表達的細胞數明顯高于對照組(P＜0.05)。高、中、低濃度組TNF-α的陽性細胞計數組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。高濃度組IL-1α的陽性細胞計數相對低濃度組較高(P＜0.05)，但高、中濃度組以及中、低濃度組間比較，差異均無顯著統(tǒng)計學