HIF-2α和沙利度胺影響GIVM發(fā)生發(fā)展和血管生成的機(jī)制研究.pdf

1、第一部分：HIF-2α和沙利度胺對(duì)斑馬魚(yú)腸下血管發(fā)生發(fā)育的影響
　　目的：明確HIF-2α和沙利度胺對(duì)斑馬魚(yú)腸下血管發(fā)生發(fā)育的影響。
　　方法：使用HIF-2α過(guò)表達(dá)質(zhì)粒對(duì)VEGF標(biāo)記的Tg(fli1a:EGFP)y1轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)進(jìn)行顯微注射，觀察斑馬魚(yú)腸下靜脈表型，對(duì)腸下靜脈出芽情況進(jìn)行計(jì)數(shù)；對(duì)HIF-2α過(guò)表達(dá)斑馬魚(yú)胚胎給予不同濃度的沙利度胺干預(yù)（200uM、400uM、800uM），觀察斑馬魚(yú)腸下靜脈出芽情況；使用PC

2、R方法檢測(cè)斑馬魚(yú)VEGF、NOTCH、DLL4等血管生成信號(hào)通路的表達(dá)差異。
　　結(jié)果：HIF-2α過(guò)表達(dá)后將導(dǎo)致斑馬魚(yú)腸下靜脈出芽明顯增加（4.20±1.48個(gè)，P<0.05 vs.對(duì)照組）；在沙利度胺干預(yù)后，斑馬魚(yú)腸下靜脈出芽顯著減少，尤其在給予800uM沙利度胺干預(yù)時(shí)，部分斑馬魚(yú)腸下靜脈表型與正常對(duì)照組類(lèi)似；HIF-2α過(guò)表達(dá)后，VEGF、NOTCH1a、NOTCH1b、NOTCH2、DLL4表達(dá)均出現(xiàn)不同程度的上調(diào)，并且沙

3、利度胺能夠抑制上述基因的表達(dá)。
　　結(jié)論：HIF-2α能夠誘導(dǎo)斑馬魚(yú)腸下靜脈異常出芽，并且沙利度胺能夠逆轉(zhuǎn)這一作用；HIF-2α能夠促進(jìn)VEGF、NOTCH、DLL4的表達(dá)；沙利度胺能夠抑制HIF-2α誘導(dǎo)的血管生成信號(hào)通路的活化。
　　第二部分：HIF-2α和沙利度胺對(duì)斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)錄組表達(dá)的影響
　　目的：明確HIF-2α和沙利度胺對(duì)斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)錄組表達(dá)的影響；探討沙利度胺對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞非編碼小RNA的調(diào)控；預(yù)測(cè)核仁素和snoR

4、NA之間的結(jié)合強(qiáng)度和位點(diǎn)。方法：使用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序芯片對(duì)HIF-2α過(guò)表達(dá)和HIF-2α過(guò)表達(dá)+沙利度胺干預(yù)的斑馬魚(yú)胚胎模型進(jìn)行測(cè)序分析；使用高通量small RNA測(cè)序芯片對(duì)沙利度胺干預(yù)前后的HUVEC進(jìn)行測(cè)序分析；使用CatRAPID平臺(tái)對(duì)核仁素和snoRNA進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析；使用Western Blot和PCR對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果：三組斑馬魚(yú)樣本轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析提示HIF-2α和沙利度胺對(duì)血管生成通路中VEG

5、F通路和NOTCH通路存在影響；沙利度胺對(duì)核糖體生成通路的表達(dá)存在影響，其中核仁素的表達(dá)存在差異；HUVEC非編碼小RNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)，沙利度胺干預(yù)后有13個(gè)snoRNA表達(dá)出現(xiàn)差異；其中SNORA31是唯一一個(gè)沙利度胺干預(yù)后表達(dá)穩(wěn)定升高的snoRNA；生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，SNORA31能夠和核仁素高強(qiáng)度的結(jié)合，并預(yù)測(cè)了兩者之間的高概率結(jié)合位點(diǎn)。
　　結(jié)論：HIF-2α和沙利度胺對(duì)血管生成通路具有調(diào)控作用；沙利度胺能夠影響轉(zhuǎn)錄組中核糖

6、體生成通路的表達(dá)，其中能夠使核仁素表達(dá)出現(xiàn)差異；沙利度胺能夠使SNORA31表達(dá)增高；SNORA31能夠以較高強(qiáng)度和核仁素蛋白結(jié)合。
　　第三部分：SNORA31抑制核仁素細(xì)胞膜表達(dá)初探
　　目的：初步探討SNORA31對(duì)核仁素細(xì)胞膜表達(dá)的抑制作用。
　　方法：使用免疫組化法驗(yàn)證核仁素在小腸血管畸形患者中的表達(dá)；使用小管生成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證細(xì)胞膜表面核仁素對(duì)HUVEC成管的作用；使用細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)Lenti-SNORA31

7、轉(zhuǎn)染HUVEC細(xì)胞膜核仁素表達(dá)情況，觀察SNORA31-siRNAs干擾后細(xì)胞膜核仁素表達(dá)情況，研究SNORA31片段對(duì)HUVEC細(xì)胞膜核仁素表達(dá)的抑制作用。
　　結(jié)果：免疫組化提示在小腸血管畸形標(biāo)本中，血管內(nèi)皮細(xì)胞核仁素表達(dá)升高；在抑制了HUVEC表面核仁素之后，HUVEC成管能力顯著下降；干擾SNORA31表達(dá)后，HUVEC細(xì)胞膜表面核仁素表達(dá)有增高趨勢(shì)；過(guò)表達(dá)SNORA31將減少核仁素在細(xì)胞膜的表達(dá)；包含H BOX區(qū)域的SN