臨床常見革蘭氏陽性球菌蛋白指紋庫的構(gòu)建.pdf

1、目的：建立包含金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、糞腸球菌和屎腸球菌共5種臨床常見革蘭氏陽性球菌蛋白指紋模型的蛋白指紋庫，并通過與分子生物學(xué)方法鑒定結(jié)果比較，驗(yàn)證其診斷效率，為細(xì)菌快速鑒定奠定基礎(chǔ)。
　　方法：1.收集從臨床中分離獲得的革蘭氏陽性球菌，包括金黃色葡萄球菌50株、表皮葡萄球菌30株、溶血性葡萄球菌45株、糞腸球菌30株和屎腸球菌30株，共185株。2.利用16S rDNA測序技術(shù)對所收集的細(xì)菌進(jìn)行分子生物學(xué)

2、鑒定。3.利用表面增強(qiáng)激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測細(xì)菌蛋白，ProteinChip和Biomarker Wizard軟件自動(dòng)采集數(shù)據(jù)，并分析所得的細(xì)菌蛋白指紋圖譜。4.通過多次檢測同一株細(xì)菌蛋白并分析其蛋白指紋圖譜差異，評(píng)價(jià)此檢測方法的重復(fù)性。5.通過比較同種細(xì)菌不同株之間蛋白指紋圖譜差異，分析細(xì)菌蛋白表達(dá)的穩(wěn)定性。6.通過比較不同培養(yǎng)時(shí)間下細(xì)菌蛋白指紋圖譜差異，驗(yàn)證培養(yǎng)時(shí)間對細(xì)菌蛋白指紋圖譜的影響。7.將185株菌株分成建模組和驗(yàn)證組

3、，建模組包括5種細(xì)菌各20株，其余85株為驗(yàn)證組；分別檢測其蛋白表達(dá)，分析其蛋白指紋圖譜，篩選出建模組每種細(xì)菌各自穩(wěn)定表達(dá)的蛋白峰，對每個(gè)蛋白峰的分子量求均值，構(gòu)建各種細(xì)菌的蛋白指紋模型，并將數(shù)據(jù)導(dǎo)入自建的Fingerwave軟件建立臨床常見革蘭氏陽性球菌的蛋白指紋庫。8.將驗(yàn)證組細(xì)菌的蛋白峰數(shù)據(jù)與蛋白指紋庫中蛋白峰數(shù)據(jù)進(jìn)行相似度分析，相似度最高的為驗(yàn)證組細(xì)菌的鑒定結(jié)果。該結(jié)果與傳統(tǒng)方法學(xué)及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果進(jìn)行比較，以評(píng)價(jià)其鑒定符合率

4、。
　　結(jié)果：1.PCR產(chǎn)物測序結(jié)果顯示，各實(shí)驗(yàn)菌株目的片段DNA序列與GenBank中該菌株基因序列一致性≥98.5％，鑒定為相應(yīng)的細(xì)菌(均與傳統(tǒng)的微生物鑒定結(jié)果相符)。2.在分子量3000-20000Da范圍內(nèi)，5種革蘭氏陽性球菌有各自特異的蛋白指紋圖譜。3.SELDI-TOF MS檢測細(xì)菌蛋白的孔間重復(fù)性和芯片間重復(fù)性好，同一株細(xì)菌多次重復(fù)的蛋白指紋圖譜相似。4.同種細(xì)菌不同株之間蛋白指紋圖譜表達(dá)穩(wěn)定，共有蛋白峰分子量變異系

5、數(shù)≤0.5％。5.不同培養(yǎng)時(shí)間對細(xì)菌蛋白指紋圖譜影響不大。6.該研究篩選了5種細(xì)菌各自穩(wěn)定表達(dá)的蛋白峰，建立了包含5種臨床常見革蘭氏陽性球菌的蛋白指紋庫。7.利用建立的數(shù)據(jù)庫對驗(yàn)證組菌株進(jìn)行鑒定，結(jié)果與應(yīng)用傳統(tǒng)微生物學(xué)鑒定及分子生物學(xué)方法獲得的鑒定結(jié)果的符合率為100％。
　　結(jié)論：利用SELDI-FOF MS技術(shù)結(jié)合自建Fingerwave軟件鑒定臨床常見革蘭氏陽性球菌，為細(xì)菌的快速鑒定提供了新方法，進(jìn)一步擴(kuò)大并完善該研究中建立