信號分子對革蘭氏陽性病原菌代謝和感染的調(diào)控機(jī)制.pdf

1、細(xì)菌依賴不同的信號調(diào)節(jié)系統(tǒng)以響應(yīng)不斷變化的環(huán)境，實(shí)時(shí)調(diào)整胞內(nèi)代謝途徑。病原菌的代謝途徑更為復(fù)雜，還需要高效的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)來介導(dǎo)細(xì)菌與宿主的相互作用，或逃避宿主的免疫系統(tǒng)，建立感染。核苷類第二信分子和生物素都是細(xì)菌重要的信號分子，調(diào)控著包括中心代謝途徑、細(xì)胞組成、運(yùn)動能力、毒力等重要的生理活動。
　　(1) c-di-AMP對金黃色葡萄球菌小菌落突變體代謝和感染的調(diào)控機(jī)制研究
　　金黃色葡萄球菌(Staphylococcus

2、aureus)是人類重要的條件致病菌，可引發(fā)皮膚感染和呼吸道疾病。金黃色葡萄球菌小菌落突變體(S.aureus small colony variant，S.aureus SCV)通常是指甲萘醌、血紅素和胸腺嘧啶核苷等營養(yǎng)缺陷型，其生長緩慢，具有耐藥性，在固體培養(yǎng)基上形成微小菌落。胸腺嘧啶核苷依賴型小菌落突變體(S.aureus thymidine-dependent SCV，S.aureus TD-SCV)是由于胸腺嘧啶核苷酸合酶Th

3、yA失活突變引起的，必須通過攝取外源的胸腺嘧啶核苷而生長，通常在經(jīng)過磺胺甲惡唑和甲氧芐啶長期治療的遺傳性囊性纖維化(cystic fibrosis)肺炎病人體內(nèi)出現(xiàn)，引起嚴(yán)重感染，并造成肺損傷。
　　核苷類第二信使環(huán)二腺苷酸(c-di-AMP)是細(xì)菌特有的核苷類第二信使分子，由二腺苷酸環(huán)化酶合成，被特異性的磷酸二酯酶降解，真核生物缺乏合成或降解c-di-AMP的相關(guān)蛋白。c-di-AMP參與調(diào)控細(xì)菌中心代謝、細(xì)胞壁合成、滲透壓適應(yīng)

4、以及抗生素抗性等生理活動，并可與宿主細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)接頭蛋白STING結(jié)合，激活天然免疫反應(yīng)。
　　本研究通過分別敲除S.aureus Newman胸腺嘧啶核苷酸合酶基因thyA和膽色素原合酶編碼基因hemB得到了胸腺嘧啶核苷依賴型-SCVΔthyA和血紅素依賴型-SCVΔhemB。通過巨噬細(xì)胞、小鼠感染實(shí)驗(yàn)和Taqman免疫基因芯片分析，發(fā)現(xiàn)ΔthyA相對于野生型菌株和SCV對照菌株ΔhemB，在胸腺嘧啶核苷缺乏時(shí)，能夠產(chǎn)生更高濃度的

5、c-di-AMP，激活依賴于STING蛋白的天然免疫反應(yīng)。而高濃度的c-di-AMP會導(dǎo)致ΔthyA基因組突變率升高，增強(qiáng)細(xì)菌的適應(yīng)性。本研究很好地解釋了TD-SCV能引起高炎癥反應(yīng)，并造成更嚴(yán)重的肺損傷的原因。
　　PstA是一個(gè)PⅡ家族信號傳遞蛋白，同時(shí)也是c-di-AMP受體蛋白。本研究通過細(xì)菌雙雜交實(shí)驗(yàn)和體外酶活測定發(fā)現(xiàn)，PstA在c-di-AMP的存在下能夠和胸腺嘧啶核苷酸激酶相互作用，并促進(jìn)其激酶活性，促進(jìn)胸腺嘧啶核苷

6、的利用，幫助ΔthyA在缺乏胸腺嘧啶核苷的環(huán)境下生存。本研究首次揭示了c-di-AMP通過調(diào)控胸腺嘧啶核苷利用而參與中心代謝的機(jī)制。
　　(2)蘇云金芽胞桿菌c-di-GMP核糖開關(guān)Be2 RNA的調(diào)控機(jī)制研究
　　蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)是一類桿狀、產(chǎn)芽胞的革蘭氏陽性細(xì)菌，也是昆蟲致病菌。B.thuringiensis的生活周期主要分為營養(yǎng)期和芽胞形成期，在芽胞形成期可以產(chǎn)生由殺蟲晶體

7、蛋白組成的伴胞晶體，具有廣譜殺蟲活性。目前，B.thuringiensis制劑目前是世界上使用最廣泛的微生物殺蟲劑，研究B.thuringiensis生長代謝、生活周期等有很大的應(yīng)用價(jià)值。
　　環(huán)二鳥苷單磷酸c-di-GMP是廣泛分布于細(xì)菌中的重要核苷類第二信使分子，通過結(jié)合不同的效應(yīng)蛋白或核糖開關(guān)來調(diào)控細(xì)菌的毒力、細(xì)胞周期、生物被膜形成、運(yùn)動性等多種生理活動。細(xì)菌通過二鳥苷酸環(huán)化酶和磷酸二酯酶來控制胞內(nèi)c-di-GMP的濃度。核

8、糖開關(guān)是位于mRNA非翻譯區(qū)的一段具有調(diào)控功能的sRNA，典型的核糖開關(guān)由適體區(qū)域和下游的表達(dá)平臺區(qū)域緊密相連而成。
　　本研究發(fā)現(xiàn)在B.thuringiensis BMB171編碼膠原粘附蛋白(Cap) mRNA的5'-非翻譯區(qū)存在一個(gè)c-di-GMP核糖關(guān)Bc2 RNA。本研究通過體外轉(zhuǎn)錄終止實(shí)驗(yàn)，并在c-di-GMP低濃度和高濃度突變株中，通過β-半乳糖苷酶實(shí)驗(yàn)、熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，揭示了Bc2 RNA表達(dá)平臺區(qū)的終止子結(jié)構(gòu)

9、會強(qiáng)烈地抑制下游基因cap的轉(zhuǎn)錄，當(dāng)結(jié)合c-di-GMP后，會引起B(yǎng)c2 RNA變構(gòu)，并形成抗終止子結(jié)構(gòu)，解除對cap的轉(zhuǎn)錄抑制。敲除Bc2 RNA會導(dǎo)致cap超表達(dá)，從而抑制細(xì)菌的運(yùn)動、胞外多糖的分泌和生物被膜的形成，同時(shí)促進(jìn)細(xì)菌的沉降并影響細(xì)菌對棉鈴蟲的毒力。本研究首次提出了“抑制-去抑制”模型，并且Bc2 RNA是蠟樣芽胞桿菌群中第一個(gè)被實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證功能的c-di-GMP核糖開關(guān)。
　　(3)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子BioQ介導(dǎo)的生物素合成

10、調(diào)控系統(tǒng)研究
　　結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)感染引起的慢性傳染病，可以感染人體的各種器官或組織，但主要侵染肺部。大多數(shù)抗結(jié)核藥物只對生長期的結(jié)核分枝桿菌有效，而不能清除潛伏期的結(jié)核分枝桿菌，多耐藥結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)使得結(jié)核病的防控形勢變得更加嚴(yán)峻，現(xiàn)有的抗結(jié)核藥物已經(jīng)不能滿足醫(yī)療的需要，迫切需要從結(jié)核分枝桿菌鑒定新的靶標(biāo)，開發(fā)出新型藥物。
　　生物素是所有生物都必須的維生素

11、。它作為羧化酶的輔因子，對分枝桿菌的中心代謝和脂肪酸合成途徑非常重要，活動期和潛伏期的結(jié)核分枝桿菌都必須依賴自身合成生物素而生存，破壞生物素合成途徑會抑制結(jié)核分枝桿菌的生長并導(dǎo)致其喪失致病性。哺乳動物不具有生物素合成相關(guān)的基因，所以生物素合成途徑已經(jīng)成為新型抗結(jié)核藥物的靶標(biāo)。
　　本研究以生長迅速、不致病的恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)為模式菌株，系統(tǒng)地探究了生物素代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，為分枝桿菌生物素代謝研究奠定了

12、基礎(chǔ)。
　　經(jīng)典的生物調(diào)節(jié)系統(tǒng)依賴雙功能酶BirA，一方面作為生物素-蛋白連接酶調(diào)控生物素的利用，一方面作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子控制生物的合成與轉(zhuǎn)運(yùn)。分枝桿菌的BirA缺乏轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的功能，我們在恥垢分枝桿菌中鑒定到了一個(gè)TetR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子BioQ，它補(bǔ)償了BirA轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的功能，本研究揭示了以BirA和BioQ協(xié)同介導(dǎo)的生物素代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)。
　　BioQ是TetR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，本研究通過凝膠阻滯、DNaseⅠ足