PKC-ζ活化在SDF-1趨化人表皮干細(xì)胞遷移中作用的初步研究.pdf

1、各種戰(zhàn)創(chuàng)傷會造成機體體表損傷和器官功能損害，使機體內(nèi)環(huán)境紊亂、感染、出血、疼痛等，甚至休克死亡。在變化不定的外環(huán)境中，人體最大的器官皮膚能夠有效抵御有害物質(zhì)入侵，保持機體內(nèi)環(huán)境相對穩(wěn)定，維持機體各種正常功能。機體體表受損時，盡快覆蓋創(chuàng)面和加速創(chuàng)面愈合有助于機體免于脫水、損傷和進一步感染。皮膚創(chuàng)面愈合是多種細(xì)胞、細(xì)胞因子及細(xì)胞外基質(zhì)共同參與的復(fù)雜過程。一般分為三個階段：1、炎性反應(yīng)階段。2、細(xì)胞遷移增殖，肉芽組織形成階段。3、創(chuàng)面重塑改建

2、階段。
　　 研究創(chuàng)面愈合過程的機理一直以來是戰(zhàn)創(chuàng)傷研究的熱點。
　　 在促進創(chuàng)面愈合的研究中，表皮干細(xì)胞(epidermAlstem cell，ESC)日益受到人們的重視。表皮干細(xì)胞是位于皮膚表皮基底層，具有自我更新、高度增殖和多向分化能力的一類細(xì)胞。數(shù)量約占表皮基底層的1％～10％。是皮膚發(fā)生、修復(fù)、改建的主要功能細(xì)胞。它維持皮膚新陳代謝，在創(chuàng)傷形成后，它會代償性增殖和定向分化來參與損傷修復(fù)。表皮干細(xì)胞從創(chuàng)緣向創(chuàng)面中

3、心增殖分化覆蓋創(chuàng)面的過程就是創(chuàng)傷后的創(chuàng)面上皮化過程。創(chuàng)面上皮化在創(chuàng)面愈合中尤為重要。更好更快的促進表皮干細(xì)胞實現(xiàn)功能是加快創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵。
　　 干細(xì)胞實現(xiàn)功能從原位進入到靶位遷移運動的過程受趨化因子/趨化因子受體系統(tǒng)調(diào)控。間質(zhì)細(xì)胞衍生因子(StromAlcell derived factor-1，SDF-1)和其特異性受體趨化因子亞家族CXC 成員CXCR4 共同組成SDF-1/CXCR4 軸，廣泛表達于多種組織細(xì)胞中，參與胚

4、胎造血遷移、胚胎發(fā)育、造血生成、組織再生重塑、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移及創(chuàng)面愈合等一系列生理、病理過程的調(diào)節(jié)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)趨化因子SDF-1的特異性受體CXCR4在表皮細(xì)胞表達，并且在越靠近表皮基底膜部位細(xì)胞胞膜表達水平越高，在急性創(chuàng)傷傷口及創(chuàng)緣部位的SDF-1分泌量較慢性創(chuàng)面明顯增多，SDF-1在受損組織部位的基因和蛋白表達比正常皮膚組織高。對三維皮膚等價物全層皮膚創(chuàng)面模型觀察發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)緣部位SDF-1的量增多時，創(chuàng)緣基底層β1整合素表達陽性的

5、細(xì)胞數(shù)量增多且向表層遷移積聚，說明SDF-1通過作用受體CXCR4 趨化表皮干細(xì)胞向創(chuàng)緣遷移，參與創(chuàng)面的修復(fù)。但是SDF-1通過作用CXCR4 趨化ESC 遷移的信號通路及調(diào)控機制仍不十分明確。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶C(Protein Kinase C，PKC)能夠上調(diào)SDF-1的表達。PKC是一組絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。包含有三個亞家族：cPKC (classicAlPKC，包括α、β1、β2、γ亞類)；nPKC (nov

6、el PKC，包括δ、ε、η、θ亞類)；aPKC（atypicalPKC，包括ι/λ、ζ亞類)。PKC信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是細(xì)胞內(nèi)重要信號通路，PKC作為重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。PKC通過催化絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)底物磷酸化，轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞信號，在細(xì)胞信號作用下調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、生長、增殖、分化、凋亡和遷移運動。
　　 不同的PKC 亞型的結(jié)構(gòu)功能是不同的。研究表明，在內(nèi)皮細(xì)胞的遷移運動中PKC-α
　　 的表達水平增高。

7、PKC-α被發(fā)現(xiàn)與結(jié)腸癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞的遷移啟動有關(guān)。PKC-β、PKC-δ、PKC-θ、PKC-ζ與細(xì)胞遷移運動有關(guān)。PKC-ζ在SDF-1趨化人CD34+祖細(xì)胞、人間充質(zhì)干細(xì)胞運動中起調(diào)節(jié)作用。在趨化因子趨化分葉核白細(xì)胞的粘附和肌動蛋白聚合中也有PKC-ζ的參與。抑制PKC-ζ的活性會使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞SDF-1表達降低，遷移運動能力減弱。目前，對于趨化因子SDF-1與其受體CXCR4 結(jié)合后，趨化表皮干細(xì)胞遷移運動的信號通路機制

8、研究依舊不清楚。研究PKC-ζ是否會在SDF-1趨化人表皮干細(xì)胞遷移運動的信號傳導(dǎo)中起作用，它的活性會如何變化，是否影響SDF-1趨化人表皮干細(xì)胞的細(xì)胞骨架變化，是本研究的研究重點。
　　 本研究主要目的、方法、結(jié)果和結(jié)論如下：
　　 一、目的
　　 初步探討在趨化因子SDF-1與其受體CXCR4 結(jié)合趨化表皮干細(xì)胞遷移運動中信號蛋白PKC-ζ的作用及其可能的機制，為進一步研究趨化因子SDF-1趨化表皮干細(xì)胞遷移

9、運動信號通路，調(diào)控表皮干細(xì)胞遷移，促進創(chuàng)面愈合提供思路。
　　 二、方法
　　 1．從正常人包皮組織中消化分離得到表皮細(xì)胞，用人胎盤IV 型膠原快速粘附法分選人表皮干細(xì)胞，在DK-SFM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。對體外培養(yǎng)的細(xì)胞進行形態(tài)學(xué)觀察，免疫化學(xué)染色檢測表皮干細(xì)胞標(biāo)志物β1整合素和角蛋白K19。
　　 2．Transwell 實驗分析不同PKC 亞型抑制劑Staurosporine、Chelerythrinechlo

10、ride和PS-ζ對SDF-1趨化人表皮干細(xì)胞遷移運動的影響。
　　 3．Western blot 實驗檢測SDF-1對人表皮干細(xì)胞作用后不同時間PKC-ζ磷酸化水平。
　　 4．激光共聚焦成像觀察PKC-ζ抑制劑PS-ζ對SDF-1趨化人表皮干細(xì)胞極化形態(tài)影響，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞骨架蛋白熒光強度變化。
　　 三、結(jié)果
　　 1．對體外分離培養(yǎng)的細(xì)胞進行形態(tài)學(xué)觀察，符合人表皮干細(xì)胞形態(tài)特點。免疫化學(xué)染色發(fā)

11、現(xiàn)人表皮干細(xì)胞標(biāo)志物β1整合素和角蛋白K19在細(xì)胞質(zhì)中呈棕黃色的陽性表達。
　　 2．趨化運動分析顯示，空白對照組的趨化指數(shù)0.89±0.11，陽性對照組的趨化指數(shù)11.39±0.38， 3個PKC 亞型抑制劑Staurosporine、Chelerythrine chloride、PS-ζ處理組的趨化指數(shù)分別是9.88±0.26、0.67±0.11、1.44±0.17，其中PS-ζ
　　 處理組和陽性對照組之間差異顯著

12、(P＜0.05)，和空白對照組之間差異不顯著(P＞
　　 0.05)。
　　 3．SDF-1對人表皮干細(xì)胞作用后不同時間PKC-ζ磷酸化水平，在沒有任何處理時，即在0min時，人表皮干細(xì)胞內(nèi)無明顯PKC-ζ活化(即PKC-ζ的磷酸化)；而SDF-1作用表皮干細(xì)胞1min后，人表皮干細(xì)胞內(nèi)p-PKC-ζ表達水平升高。
　　 4．用激光共聚焦顯微鏡對具有代表性的細(xì)胞極化形態(tài)現(xiàn)象照相，陽性對照組的細(xì)胞在SDF-1的作用

13、下，相對于陰性對照組的細(xì)胞，呈現(xiàn)遷移運動狀，伸出片層狀偽足。
　　 而用PKC-ζ的特異性抑制物PS-ζ處理后的人表皮干細(xì)胞，同陰性對照組細(xì)胞相比較，細(xì)胞骨架變化不明顯，未見偽足伸出；用流式細(xì)胞儀對人表皮干細(xì)胞的細(xì)胞骨架蛋白熒光強度進行了檢測，發(fā)現(xiàn)陽性對照組的細(xì)胞在SDF-1的作用后，細(xì)胞骨架熒光強度增高，均高于陰性對照組的細(xì)胞，而用PKC-ζ的特異性抑制物PS-ζ處理后的人表皮干細(xì)胞，即處理組細(xì)胞，在SDF-1的作用后，細(xì)胞骨

14、架熒光強度并未出現(xiàn)同陽性對照組相似的增高情況，同陰性對照組細(xì)胞相比較，細(xì)胞熒光強度變化不明顯。
　　 四、結(jié)論
　　 1．體外成功分離、培養(yǎng)出了人表皮干細(xì)胞。表皮干細(xì)胞的表面標(biāo)志物β1整合素和角蛋白K19免疫細(xì)胞化學(xué)染色呈棕黃色著色的陽性表達。說明體外分離培養(yǎng)出細(xì)胞符合人表皮干細(xì)胞鑒定特征。
　　 2．特異性的抑制PKC-ζ使趨化因子SDF-1對人表皮干細(xì)胞的趨化活性顯著降低。
　　 3．趨化因子SDF-