誘導(dǎo)視網(wǎng)膜干細(xì)胞向神經(jīng)節(jié)-祖細(xì)胞分化及SDF-1對(duì)其遷移作用的研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　視神經(jīng)損傷是眼科臨床中常見(jiàn)的損傷類型,常導(dǎo)致失明。視神經(jīng)屬于中樞神經(jīng),由視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells,RGCs)軸索組成,損傷后再生困難而難以修復(fù)。目前對(duì)于這類疾病尚無(wú)有效的治療方式,仍以激素沖擊、手術(shù)治療、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子輔助等綜合性治療為主。由于視神經(jīng)損傷后神經(jīng)節(jié)細(xì)胞大量丟失及凋亡,導(dǎo)致視功能受損,因此減少節(jié)細(xì)胞的凋亡和提高存活率是治療的關(guān)鍵。
　　作為細(xì)胞替代治療的方

2、法之一,干細(xì)胞移植技術(shù)的發(fā)展為視神經(jīng)損傷后的修復(fù)與再生帶來(lái)了新的希望。干細(xì)胞能不斷分裂進(jìn)行自我復(fù)制,并根據(jù)不同的微環(huán)境和觸發(fā)條件分化為不同的細(xì)胞。視網(wǎng)膜干細(xì)胞(retinal stem cells,RSCs)屬于成體干細(xì)胞,可以分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞,目前在視神經(jīng)損傷后的修復(fù)治療中被作為移植的種子細(xì)胞進(jìn)行研究。然而,是先在體外將干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成目標(biāo)細(xì)胞后再移植,還是先移植干細(xì)胞,然后在組織微環(huán)境的誘導(dǎo)下使其分化為目標(biāo)細(xì)胞,哪一種方法效果

3、比較好,目前爭(zhēng)議比較多。
　　我們希望找到既具有干細(xì)胞的增殖能力,又具有神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的部分特性,并陰性表達(dá)成熟 RGC特異性標(biāo)記物的細(xì)胞群,即視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)祖細(xì)胞(retinal ganglion progenitor cell,RGPC),避免干細(xì)胞移植后分化的不確定性,又仍有一定的增殖能力和可塑性,為將來(lái)細(xì)胞移植治療視神經(jīng)損傷提供新的幫助。
　　細(xì)胞替代治療還需要移植細(xì)胞定向遷移到損傷區(qū)域,和受體組織進(jìn)行整合后才能發(fā)揮功能學(xué)

4、效應(yīng)。基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor1,SDF-1)對(duì)于許多類型的細(xì)胞均有遷移作用,研究認(rèn)為它對(duì)于干細(xì)胞的遷移有重要作用。
　　本課題的研究目的在于探尋干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)祖細(xì)胞的方法,并研究SDF-1是否能促進(jìn)RGPC定向遷移以提高移植效率,為視神經(jīng)損傷修復(fù)的細(xì)胞移植替代療法提供新的方法。
　　方法:
　　第一部分:誘導(dǎo)視網(wǎng)膜干細(xì)胞向視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分化方法的

5、探討及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)祖細(xì)胞篩選的研究
　　1.取E13.5的LE胚胎鼠,分離得到視網(wǎng)膜干細(xì)胞并進(jìn)行傳代培養(yǎng)。干細(xì)胞標(biāo)記物鑒定傳2代的RSC。
　　2.分別用DAPT、BDNF、DAPT聯(lián)合BDNF組和5％血清對(duì)照組誘導(dǎo)傳2代的RSC分化14d,流式細(xì)胞儀鑒定各組細(xì)胞thy1.1的陽(yáng)性率。
　　3.分別用DAPT聯(lián)合BDNF分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)傳2代的RSC1d、3d和5d,鑒定干細(xì)胞標(biāo)記物nestin、ki67和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)

6、胞相關(guān)標(biāo)記物math5、brn3b和thy1.1的表達(dá)。
　　第二部分:SDF-1對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)祖細(xì)胞遷移作用的實(shí)驗(yàn)研究
　　1. DAPT聯(lián)合 BDNF分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)傳2代 RSC分化3天后取出細(xì)胞,鑒定RGPC相關(guān)標(biāo)記物和細(xì)胞膜表面CXCR4受體的表達(dá)情況。
　　2.設(shè)置SDF-1組、SDF-1聯(lián)合CXCR4阻斷劑(AM3100)組、空白對(duì)照組,觀察各組細(xì)胞的遷移情況。
　　3.設(shè)置不同濃度的 SDF-1實(shí)驗(yàn)

7、組和空白對(duì)照組,觀察不同濃度下各組細(xì)胞的遷移情況。
　　結(jié)果:
　　第一部分:誘導(dǎo)視網(wǎng)膜干細(xì)胞向視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分化方法的探討及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)祖細(xì)胞篩選的研究
　　1.傳2代RSC干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物chx10、nestin和ki67均陽(yáng)性表達(dá),并且RGC早期相關(guān)標(biāo)記物math5也陽(yáng)性表達(dá),brn3b和成熟RGC特異性標(biāo)記物thy1.1陰性表達(dá)。
　　2.各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間thy1.1陽(yáng)性率均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,DAPT聯(lián)

8、合BDNF組thy1.1陽(yáng)性率最高,與各組之間均有顯著性差異。
　　3. DAPT聯(lián)合BDNF誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)RSC分化3d后部分細(xì)胞nestin、ki67、math5和brn3b陽(yáng)性表達(dá),thy1.1陰性表達(dá),細(xì)胞成為既具有干細(xì)胞增殖能力,又具有部分RGC特性,同時(shí)未完全發(fā)育為成熟RGC的RGPC。
　　第二部分:SDF-1對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)祖細(xì)胞遷移作用的實(shí)驗(yàn)研究
　　1. DAPT聯(lián)合BDNF分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)傳2代R

9、SCs分化3d后,RGPC細(xì)胞膜表面CXCR4受體表達(dá)陽(yáng)性。
　　2. SDF-1能使RGPC細(xì)胞發(fā)生遷移,AMD3100通過(guò)阻斷SDF-1與CXCR4的結(jié)合降低SDF-1對(duì)RGPC遷移的趨化作用。
　　3. SDF-1對(duì) RGPC的遷移在一定范圍內(nèi)受濃度梯度調(diào)控,濃度越高促遷移能力越強(qiáng),當(dāng)濃度達(dá)到500ng/ml時(shí)細(xì)胞遷移指數(shù)最高,達(dá)到最大趨化濃度。
　　結(jié)論:
　　本課題研究了提高體外RSC分化為RGC的分化