SDF-1α-CXCR4調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞遷移的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的:研究SDF-1α/CXCR4配體/受體軸在神經(jīng)干細(xì)胞遷移過程中的調(diào)節(jié)作用。 研究方法: 1. 胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及CXCR4表達(dá)：采用機(jī)械分離、無血清選擇性連續(xù)傳代培養(yǎng)法從孕14天GFP轉(zhuǎn)基因大鼠胚胎大腦皮層中獲取神經(jīng)干細(xì)胞；通過細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)、熒光免疫細(xì)胞化學(xué)染色的方法檢測(cè)其神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)志物Nestin蛋白及基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α特異性受體CXCR4的表達(dá)情況，并使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞

2、純度及CXCR4與Nestin的共表達(dá)率。 2. SDF-1α影響神經(jīng)干細(xì)胞遷移的體外研究：在Blind-Well小室的下室中加入不同濃度SDF-1α，上室中加入神經(jīng)干細(xì)胞單細(xì)胞懸液（細(xì)胞總量為5×104），培養(yǎng)箱中孵育8h后觀察不同濃度SDF-1α對(duì)遷移至濾膜下表面NSCs數(shù)量的影響；將CXCR4受體激動(dòng)劑Diprotin A預(yù)混入下室中含一定濃度SDF-1α的干細(xì)胞分化培養(yǎng)液或上室中換用CXCR4受體阻斷劑預(yù)處理的單細(xì)胞懸液

3、，孵育8h后觀察遷移至濾膜下表面細(xì)胞數(shù)量的變化。將干細(xì)胞克隆球接種于μ-Slide的細(xì)胞生長(zhǎng)通道內(nèi)，待細(xì)胞球牢固貼附后建立跨越細(xì)胞生長(zhǎng)通道的0ng/ml～500ng/ml SDF-1α濃度梯度，并同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組和500ng/ml Balance-SDF-1α組（只提高細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境中SDF-1α的濃度，而不形成濃度梯度），培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育8h后觀察由單個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞克隆球遷出的細(xì)胞在SDF-1α濃度梯度作用下的分布特點(diǎn)；將單個(gè)干細(xì)胞克隆

4、球作為所在組的一個(gè)樣本，以干細(xì)胞克隆球的中心為圓點(diǎn)，以SDF-1α低濃度一側(cè)遷出細(xì)胞所在位置距圓點(diǎn)的最近距離為半徑R擬合一個(gè)圓形，同時(shí)測(cè)量SDF-1α高濃度一側(cè)遷出細(xì)胞所在位置距圓點(diǎn)的最遠(yuǎn)距離D，計(jì)算該例樣本的趨化遷移指數(shù)（chemotaxis migration index，CMI），即(D-R)/R，以之作為評(píng)估神經(jīng)干細(xì)胞定向遷移程度的指標(biāo)并用于后續(xù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 研究結(jié)果： 1. 胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及

5、CXCR4表達(dá)：采用無血清選擇性連續(xù)傳代培養(yǎng)法可以從大鼠胚胎大腦皮層中獲取神經(jīng)干細(xì)胞，在體外培養(yǎng)條件下能夠不斷增殖，并具有分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的潛能；熒光免疫細(xì)胞化學(xué)染色的方法證實(shí)我們培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞能夠表達(dá)特異性標(biāo)志物Nestin蛋白和SDF-1α的特異性受體CXCR4；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，傳3代后細(xì)胞的Nestin陽性率達(dá)到90.47％～98.16％，CXCR4與Nestin的共表達(dá)率為78.99％。 2. SDF-1

6、α影響神經(jīng)干細(xì)胞遷移的體外研究：Blind-Well小室細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)中，除1ng/ml SDF-1α組之外的其他各濃度組（10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml和1000ng/ml）與空白對(duì)照組（0ng/ml）之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；500ng/ml SDF-1α組的細(xì)胞遷移數(shù)量高于其他各濃度組，與除1000ng/ml SDF-1α組之外的其他各濃度組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；C

7、XCR4受體激動(dòng)劑Diprotin A和受體阻斷劑AMD3100分別能夠增加和減少100ng/ml SDF-1α組的細(xì)胞遷移數(shù)量。Μ-Slide細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，在SDF-1α濃度梯度作用下，由細(xì)胞克隆球遷出的細(xì)胞呈不對(duì)稱分布，通常有更多的遷出細(xì)胞分布于趨化因子濃度較高的一側(cè)，且該側(cè)細(xì)胞的最大遷移距離往往也比對(duì)側(cè)遠(yuǎn)；以趨化遷移指數(shù)（CMI）作為評(píng)估神經(jīng)干細(xì)胞定向遷移程度的指標(biāo)，500ng/ml SDF-1α濃度梯度組CMI與空白對(duì)照組（0

8、ng/ml）和500ng/ml Balance-SDF-1α組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 研究結(jié)論： 1. 采用機(jī)械分離、無血清選擇性連續(xù)傳代培養(yǎng)法能夠從GFP轉(zhuǎn)基因大鼠胚胎大腦皮層中獲得純度較高且具有多向分化潛能的神經(jīng)干細(xì)胞；SDF-1α的特異性受體CXCR4在胎鼠腦組織來源的神經(jīng)干細(xì)胞上有表達(dá)，其表達(dá)率接近80％。 2. SDF-1α與其特異性受體CXCR4相互作用，能夠?qū)ι窠?jīng)干細(xì)胞的定向遷移產(chǎn)