SDF-1α基因的克隆及其對THP-1細胞的遷移作用.pdf

1、背景：動脈粥樣硬化是一種動脈血管壁慢性炎癥性疾病，其確切機制還未完全闡明，很多因素可促進其發(fā)生發(fā)展。而趨化因子是炎癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子?；|(zhì)細胞衍生因子SDF-1α（stromal cell derived- factor 1 alpha）是一類具有趨化活性的細胞因子，研究證實它在造血干細胞遷移及歸巢、惡性腫瘤尤其血液腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移以其HIV感染方面發(fā)揮著重要作用。近幾年來SDF-1α在動脈硬化性疾病中的作用也開始引起重視。 本研究

2、應(yīng)用RT-PCR法從大鼠血管平滑肌細胞（Vascular smooth muscle cells,Vsmcs;）中克隆出SDF-1α基因，并對其序列進行初步的生物信息學(xué)分析；然后構(gòu)建EGFP-C1- SDF-1α重組質(zhì)粒進行亞細胞定位分析；最后構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1-SDF-1α,研究其對單核細胞的趨化作用。 目的：克隆大鼠SDF-1α基因，并對大鼠SDF-1α基因序列進行分析；分析SDF-1α蛋白亞細胞定位；探討重組SDF

3、-1α蛋白對單核細胞的趨化作用。 方法：從大鼠Vsmcs中提取mRNA,用RT-PCR從中擴增出SDF-1α基因,將擴增片段克隆于pMD-T18載體中,轉(zhuǎn)化DH5α菌；進行藍白篩選后,運用PCR和酶切鑒定并DNA測序；利用生物信息學(xué)方法對SDF-1α基因的序列進行分析。構(gòu)建EGFP-C1- SDF-1α表達載體，酶切鑒定，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染Ecv304內(nèi)皮細胞株,48h后用熒光顯微鏡檢測綠色熒光蛋白表達；構(gòu)建重組質(zhì)粒

4、pcDNA3.1-SDF-1α，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染Ecv304內(nèi)皮細胞株，經(jīng)G418篩選陽性克隆，RT-PCR驗證，建立SDF-1α轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定表達細胞系，再用小室遷移實驗來研究SDF-1α對THP-1單核細胞的趨化作用。 結(jié)果：PCR擴增得到378bp的基因片段,經(jīng)酶切初步證實為SDF-1α基因;陽性克隆經(jīng)篩選鑒定連接有目的基因;目的基因測序結(jié)果與GeneBank上序列比較,結(jié)果完全一致,表明靶基因成功插入pMD–T；用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染

5、法將重組質(zhì)粒EGFP-C1- SDF-1α瞬時轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細胞,發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白主要在細胞質(zhì)中表達；用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-SDF-1α轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細胞，經(jīng)G418篩選陽性克隆，RT-PCR驗證，表明建立了SDF-1α轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定表達細胞系，小室遷移試驗發(fā)現(xiàn)SDF-1α對THP-1單核細胞的具有明顯趨化作用。 結(jié)論：成功克隆了SDF-1α基因，SDF-1α蛋白主要在細胞質(zhì)中表達，重組的SDF-1α對單核細胞具有趨化