急性顱腦創(chuàng)傷患者腦脊液差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、目的：重型顱腦創(chuàng)傷(traumatic brain iniury，TBI)患者死亡率很高，在30％～50％左右，存活者中也有相當(dāng)高的致殘率，因此，顱腦創(chuàng)傷嚴(yán)重威脅著人類健康，對(duì)社會(huì)和家庭造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，引起了世界各國(guó)的廣泛重視。目前如何降低該病的死亡率和致殘率仍是神經(jīng)外科領(lǐng)域的難點(diǎn)和熱點(diǎn)，對(duì)其致病和修復(fù)機(jī)制的研究，一直是神經(jīng)外科領(lǐng)域的熱點(diǎn)課題。
　　 在前期研究中，我們通過(guò)承擔(dān)國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目《急性腦創(chuàng)傷后神經(jīng)元蛋白

2、質(zhì)組表達(dá)改變的研究》(項(xiàng)目編號(hào)：30271331)，采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺(tái)，觀察了創(chuàng)傷后大腦皮層神經(jīng)組織內(nèi)蛋白質(zhì)組的變化。本研究目的是通過(guò)比較腦創(chuàng)傷后腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)蛋白組的改變，從中尋找腦源性差異蛋白，并與腦組織蛋白質(zhì)組改變進(jìn)行比較，為研究顱腑創(chuàng)傷的分子機(jī)制和生物學(xué)標(biāo)志物的尋找提供寶貴的理論基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 第一部分、我們選用從10例人腦創(chuàng)傷后行顱內(nèi)壓監(jiān)護(hù)的患者中獲取的

3、腦脊液，通過(guò)預(yù)冷丙酮除鹽濃縮，采用蛋白質(zhì)均衡技術(shù)(ProteoMinerTM試劑盒)去除高豐度蛋白并富集低豐度蛋白之后，進(jìn)行雙向凝膠電泳、硝酸銀染色和凝膠圖像處理，建立了高重復(fù)性的人類腦脊液蛋白質(zhì)組中的高豐度蛋白去除方法，進(jìn)行了方法學(xué)上的驗(yàn)證。
　　 第二部分、我們選取30例顱腦創(chuàng)傷患者和8例破裂動(dòng)脈瘤斂蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)但不伴實(shí)質(zhì)內(nèi)血腫的患者，發(fā)病后24小時(shí)內(nèi)行腦室外引流術(shù)

4、，收集的腦脊液樣本離心取上清-80℃低溫保存，混合樣本預(yù)冷丙酮除鹽濃縮，采用ProteoMinerTM試劑盒去除高豐度蛋白并富集低豐度蛋白后，Bradford法測(cè)定最終蛋白濃度，由三種熒光(Cy2，Cy3，Cy5)交叉標(biāo)記的兩種50μg樣品和內(nèi)標(biāo)混合，進(jìn)行雙向差異凝膠電泳(two-dimensional differentialin-gel electrophoresis，2D-DIGE)，使用DeCyder v.5.02圖像分析軟件分

5、析電泳結(jié)果。差異點(diǎn)通過(guò)胰蛋白酶膠內(nèi)酶切、基質(zhì)輔助激光解吸/電離-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)肽段的分子量進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，進(jìn)行蛋白鑒定，推測(cè)其生物學(xué)作用。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分、人TBI后CSF經(jīng)ProteoMinerTM處理后，經(jīng)過(guò)PDQuest7.0軟件自動(dòng)檢測(cè)到的蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)為1432±85，與常用的丙酮沉淀法檢測(cè)到的蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)1123±114相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，F(xiàn)=8.885)。通過(guò)比較

6、CSF經(jīng)ProteoMinerTM處理前后2-DE圖譜發(fā)現(xiàn)，高豐度蛋白減少，低豐度蛋白的分辨率提高。說(shuō)明ProteoMinerTM起到了富集低豐度蛋白的作用，可進(jìn)行下一步研究。
　　 第二部分、兩組患者的CSF經(jīng)過(guò)ProteoMinerTM富集低豐度蛋白后進(jìn)行2D-DIGE分離，得到清晰的腦脊液蛋白圖譜。生物學(xué)差異分析結(jié)果表明，在外傷組與對(duì)照組腦脊液蛋白共存在有表達(dá)量變化超過(guò)1.5倍的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)169個(gè)，其中在外傷組中表達(dá)上調(diào)

7、1.5倍以上的有98個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，下調(diào)1.5倍以上的有71個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。通過(guò)質(zhì)譜鑒定，47個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)被鑒別出，屬于36種蛋白產(chǎn)物。依據(jù)蛋白可能存在的生理功能將其分類為：細(xì)胞骨架、參與代謝、信號(hào)傳導(dǎo)、應(yīng)激反應(yīng)、蛋白合成與代謝和未知功能蛋白。其中銅藍(lán)蛋白、小白蛋白、KLF6因子、磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、SLC25A23、溴區(qū)包含蛋白1、F-box蛋白7與中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病有密切關(guān)系，在腦創(chuàng)傷急性期內(nèi)人CSF中首次發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平出現(xiàn)變化。