電刺激處理牛肉的差異蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、嫩度是衡量牛肉食用品質(zhì)好壞的重要指標。我國的牛肉要想進入世界牛肉主流市場，改變依賴進口優(yōu)質(zhì)牛肉的被動局面，應該將提高牛肉嫩度作為推動牛肉產(chǎn)業(yè)良性發(fā)展的核心任務。牛肉的嫩度除了受肉牛年齡和品種等生理方面的影響外，還受宰后處理方式的影響。電刺激處理對宰后成熟過程中牛肉蛋白質(zhì)的影響仍是在肉品界的研究熱點。電刺激確實提高了宰后肌肉蛋白質(zhì)的降解速度，但導致其降解的作用機制錯綜復雜，還需要進一步研究。近年來，蛋白質(zhì)組學已經(jīng)成為研究蛋白質(zhì)的熱門方法，

2、尤其是差異蛋白質(zhì)組學，通過尋找、篩選和鑒定與肉品質(zhì)性狀有相關性的標記蛋白，全面和深入洞察肉品品質(zhì)的形成機理，為進一步解釋肉品間品質(zhì)差異的根源提供了科學依據(jù)。因此，運用蛋白質(zhì)組學的方法來評估肉品品質(zhì)具有十分重要的意義。
　　本研究首先測定了牛肉品質(zhì)指標，優(yōu)化差異蛋白質(zhì)組學的雙向電泳條件，建立了牛背最長肌雙向電泳凝膠體系后，利用這個體系研究了電刺激后牛背最長肌中差異蛋白質(zhì)，分析鑒定這些蛋白質(zhì)在電刺激影響牛肉嫩度中的作用機制，探討機理。

3、
　　主要結果如下:
　　一、電刺激后牛背最長肌食用品質(zhì)指標測定
　　選擇了20頭中國黃牛（延邊?！廖鏖T塔爾牛），每組10頭，分成兩組。依據(jù)標準工藝屠宰后，一組樣品電刺激，另一組樣品作為對照。分別測定了宰后2h、6h、24h、72h牛背最長肌的溫度、pH值及宰后1d、3d的剪切力值。
　　結果表明，電刺激提高了宰后早期的胴體溫度，使pH值快速降低，降低了宰后1d、3d時的剪切力值，提高了嫩度。
　　二、建立

4、牛背最長肌雙向電泳技術體系
　　對牛背最長肌總蛋白的提取方法，包括:裂解液，上樣量，膠條pH范圍，蛋白質(zhì)定量，染色，樣品處理，聚焦條件進行優(yōu)化，建立了適合牛背最長肌總蛋白提取的方法及雙向電泳技術體系。
　　結果顯示，提取總蛋白時，選取裂解液中DTT濃度為60mmol/L,直接裂解法提取的蛋白點數(shù)量最多且分離效果最好，蛋白質(zhì)提取后使用雙向電泳配套定量試劑盒進行精確定量。由于需要研究的蛋白質(zhì)范圍越廣且越清晰越好，雙向電泳條件選擇

5、上樣量為400μg，24cm，pH3-10非線性膠條進行。等電聚焦條件為:50v水化12h，100v2h，200v1h，500v30min，1000v20min，3000v20min，5000v15000vhr，使用考馬斯亮藍染色，簡便快速，得到的蛋白點易于處理并進行下一步分析。
　　三、電刺激后牛背最長肌蛋白質(zhì)組學研究
　　利用PDQuest軟件分析宰后1d和3d時電刺激處理牛背最長肌中有顯著降解的差異蛋白點，包括凝膠圖譜

6、比對、雙向電泳分離的重復性及其效果、差異蛋白點凝膠放大及3D圖比對，然后對差異蛋白點進行質(zhì)譜鑒定分析、Real-timePCR及Westernblot鑒定分析。
　　結果顯示，與未電刺激樣品相比，在宰后1d和3d電刺激處理牛背最長肌中有12個蛋白點表達明顯下調(diào)，分為9種蛋白質(zhì):肌間線蛋白(Desmin)、肌鈣蛋白-T(TroponinTalphaisoform)、肌球蛋白結合蛋白H(MyosinbindingproteinH);肌

7、酸激酶(Creatinekinase，2個)、磷酸丙糖異構酶(Triosephosphateisomerase，2個);過氧化物氧化還原酶（Peroxiredoxin-6，2個）、磷脂酰乙醇胺結合蛋白(Phosphatidylethanolamine-bindingprotein);組蛋白(HistoneH3.3-likeisoform2)、甲基轉移酶(Methyltransferase)。
　　四、電刺激后差異蛋白質(zhì)影響嫩度的作

8、用機制
　　分析表明，電刺激后9種蛋白質(zhì)通過四條途徑影響電刺激后嫩度變化，具體機制如下:
　　1.電刺激通過糖酵解代謝途徑影響嫩度
　　電刺激后代謝酶Creatinekinase和Triosephosphateisomerase表達下調(diào)，表明電刺激加快糖酵解途徑，Creatinekinase和Triosephosphateisomerase快速消耗，pH值快速下降。
　　2.電刺激通過鈣激活中性蛋白酶途徑影響嫩度

9、
　　電刺激后骨架蛋白Desmin、TroponinTalphaisoform、MyosinbindingproteinH表達下調(diào)，表明電刺激激活Calpains蛋白酶體系，加速降解骨架蛋白Desmin、TroponinTalphaisoform、MyosinbindingproteinH，剪切力降低，嫩度提高。
　　3.電刺激通過溶酶體途徑影響嫩度
　　電刺激后Peroxiredoxin-6表達下調(diào)，表明電刺激后pH

10、不斷下降，直到極限pH為5.4左右，肌漿中Ca2+濃度升高，Peroxiredoxin-6主要發(fā)揮Ca2+依賴的磷脂酶A2活性，導致溶酶體膜破裂，溶酶體內(nèi)的水解酶釋放，使肌肉蛋白水解，嫩度提高。
　　4.電刺激通過氧化應激途徑影響嫩度
　　電刺激影響嫩度的有關氧化應激途徑主要有MAPK級聯(lián)途徑和PI3K/Akt信號通路。
　　(1)Peroxiredoxin-6在p38MAPK級聯(lián)途徑中的作用機制
　　Perox

11、iredoxin-6在pH接近中性時，發(fā)揮過氧化物氧化還原酶活性，通過p38MAPK級聯(lián)途徑刺激增殖和抑制細胞凋亡，pH為5.0左右時發(fā)揮溶酶體中的磷脂酶A2活性。電刺激后Peroxiredoxin-6表達下調(diào)，pH不斷下降，直到極限pH為5.4左右，肌漿中Ca2+濃度升高，表明Peroxiredoxin-6主要發(fā)揮Ca2+依賴的磷脂酶A2活性，通過溶酶體途徑使肌肉蛋白水解，在一定程度上抑制了p38MAPK級聯(lián)途徑，抑制增殖，加速氧化凋

12、亡，嫩度提高。
　　(2)PEBP在Ras-MAPK級聯(lián)途徑中的作用機制
　　電刺激后磷脂酰乙醇胺結合蛋白(PEBP)表達下調(diào)。牛屠宰后胴體內(nèi)產(chǎn)生活性氧，激活Ras-MAPK級聯(lián)途徑，PEBP與Raf-1相互起作用，抑制Ras-MAPK信號傳導途徑。電刺激后PEBP表達下調(diào)，表明電刺激加速PEBP抑制Ras-MAPK級聯(lián)途徑，抑制增殖，加速氧化凋亡，嫩度提高。
　　(3)MT在PI3K/Akt信號通路中的作用機制

13、>　　PI3K/Akt信號轉導通路誘導細胞的增殖，避免細胞發(fā)生凋亡，并且能夠激活甲基轉移酶(MT)。而MT表達越低，甲基化水平越低，凋亡越快。電刺激后組蛋白和甲基轉移酶下調(diào)，表明甲基轉移酶表達降低，組蛋白甲基化水平降低，加速凋亡，在一定程度上抑制了PI3K/Akt信號轉導通路，抑制增殖，加速氧化凋亡，嫩度提高。
　　電刺激通過氧化應激途徑影響嫩度的信號通路表明，牛肉嫩化與氧化、凋亡有密切聯(lián)系;電刺激在一定程度上抑制增殖，加速氧化和