狼瘡腎炎患者血清定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、目的：利用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（iTRAQ）技術(shù)結(jié)合2維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（2D-LC-MS/MS）技術(shù)篩選狼瘡腎炎（Lupus Nephritis，LN）和系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）非腎炎患者患者血清差異表達(dá)蛋白。為L(zhǎng)N的早期診斷以及病情監(jiān)控，從血清定量蛋白質(zhì)組學(xué)的方向提供新的角度和思路。
　　方法：采用LN患者和SLE非腎炎患者血清標(biāo)本作為研究對(duì)象，并以健康人群血清為對(duì)照。利用安捷倫多重親和排除系統(tǒng)(MARS)分別去除各組血

2、清中的14種高豐度蛋白，并對(duì)低豐度蛋白進(jìn)行超濾濃縮，分別標(biāo)記為：①系統(tǒng)性紅斑狼瘡腎炎組（LN-low）；②SLE非腎炎組（SLE-low）；③健康對(duì)照組（N-low）。運(yùn)用iTRAQ技術(shù)構(gòu)建SLE非腎炎患者和LN患者在疾病不同階段的差異蛋白表達(dá)譜，并將所有的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行Gene Ontology(簡(jiǎn)稱GO)分類和信號(hào)通路分析（IPA）；隨后用免疫印跡法（WB）對(duì)差異蛋白--載脂蛋白B（APOB）、補(bǔ)體C1q子組件單元C(C，C1QC

3、)和血清淀粉樣蛋白A1(SAA1)進(jìn)行蛋白水平的鑒定；最后使用SAA1（Human）ELISA Kit測(cè)定SAA1在LN、SLE非腎炎組和健康對(duì)照組血清樣本中的濃度，并用SPSS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：⑴用SDS-PAGE電泳來(lái)驗(yàn)證待測(cè)血清高豐度蛋白的去除效率,結(jié)果顯示：可見的蛋白條增多，一些原本未見的低豐度蛋白條帶顯現(xiàn)出來(lái)；使用Quantity One軟件來(lái)做進(jìn)一步的分析比較，98％以上的高豐度蛋白已被去除。⑵經(jīng)iTRAQ聯(lián)

4、合2D-LC-MS/MS分析，共鑒定出302個(gè)非冗余蛋白(95%的可信區(qū)間)。通過設(shè)置差異蛋白的篩選標(biāo)準(zhǔn)：Cut-off值為ProtScore（unused）>1.5，且P<0.05，Ratio>1.2（上調(diào)）或Ratio<0.8（下調(diào)）。得到243個(gè)差異蛋白，其中LN組與健康對(duì)照組比較，有235個(gè)差異蛋白（上調(diào)蛋白233個(gè)，下調(diào)蛋白2個(gè)）；SLE非腎炎組與健康對(duì)照組比較，有243個(gè)差異蛋白（上調(diào)蛋白3個(gè)，下調(diào)蛋白240個(gè)）；LN組與S

5、LE非腎炎組比較，有243個(gè)差異蛋白，且全部是上調(diào)蛋白。⑶生物信息分析可知，差異蛋白主要位于細(xì)胞外，發(fā)揮炎癥反應(yīng)或者急性反應(yīng)的生物學(xué)作用；在IPA分析上差異蛋白的信號(hào)途徑主要有LXR/RXR激活、FXR/RXR激活以及補(bǔ)體系統(tǒng)等。用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC曲線)分析血清SAA1在SLE非腎炎和LN的表達(dá)情況，其曲線下面積（area under the RO

6、C curve,記為AUC）診斷LN為0.843，P=0.001，當(dāng)SAA1的Cut-off值為1.555μg/mL時(shí)，靈敏度為70.5%，特異度為85.7%。
　　結(jié)論：①經(jīng)iTRAQ結(jié)合2D-LC-MS/MS技術(shù)分析，LN和SLE非腎炎之間存在243個(gè)的差異表達(dá)蛋白，且差異蛋白SAA1可能是診斷LN的潛在分子標(biāo)志物。②SLE與LN的發(fā)生發(fā)展涉及機(jī)體多條作用通路，如免疫異常、機(jī)體急性反應(yīng)以及血脂異常等。炎性反應(yīng)可能是促進(jìn)SLE與