黔產(chǎn)寬葉纈草遺傳關(guān)系的分析及揮發(fā)油質(zhì)量評價(jià)研究.pdf

1、目的：探討貴州省寬葉纈草在分子水平上的遺傳關(guān)系；并對寬葉纈草揮發(fā)油進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)研究。
　　方法:
　?。?）通過優(yōu)化PCR擴(kuò)增體系中Mix、DNA模版、引物的濃度，建立寬葉纈草RAPD及ISSR擴(kuò)增反應(yīng)體系。
　?。?）利用最佳反應(yīng)體系，篩選RAPD、ISSR隨機(jī)引物以及ISSR有效引物的最佳退火溫度。
　?。?）運(yùn)用RAPD、ISSR兩種方法分別對貴州省20個(gè)居群的寬葉纈草進(jìn)行遺傳多樣性分析，并利用NTSYS2

2、.1e軟件進(jìn)行UPGMA聚類分析。
　　(4)運(yùn)用SPSS17.0軟件對RAPD與ISSR的遺傳相似性系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。
　?。?）基于葉綠體DNA片段，利用trnL-F、matK序列對寬葉纈草進(jìn)行序列分析，運(yùn)用Bioedit、MEGA5.0軟件計(jì)算貴州省寬葉纈草居群遺傳距離，并進(jìn)行聚類分析建立系統(tǒng)發(fā)育樹。
　?。?）采用2010年版《中國藥典》中收藏的方法對寬葉纈草揮發(fā)油進(jìn)行理化性質(zhì)的測定。
　?。?）采用薄

3、層色譜鑒別法對寬葉纈草揮發(fā)油中化學(xué)成分進(jìn)行定性鑒別。
　?。?）采用氣相色譜法對寬葉纈草揮發(fā)油中乙酸龍腦酯的含量進(jìn)行測定。
　?。?）采用SPSS17.0軟件分析寬葉纈草揮發(fā)油中乙酸龍腦酯的含量與海拔高度之間的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　?。?）建立了適合寬葉纈草RAPD擴(kuò)增的反應(yīng)體系：總體積25μL，包含2×Taq PCR MasterMix16μL，DNA模板100ng，引物0.60μmol/L，ddH2O補(bǔ)齊。

4、
　?。?）建立了適合寬葉纈草ISSR擴(kuò)增的反應(yīng)體系：總體積25μL，包含2× Taq PCR MasterMix14μL，DNA模板60ng，引物0.70μmol/L，ddH2O補(bǔ)齊。
　?。?）從59條RAPD隨機(jī)引物中篩選出了17條有效RAPD引物，17條引物20份不同居群寬葉纈草共擴(kuò)增出197條條帶，其中多態(tài)性條帶158條，多態(tài)性比率80.20％，遺傳相似性系數(shù)0.4010～0.9391。
　?。?）從50條I

5、SSR引物中篩選出了17條有效ISSR引物，并確定了各引物的最佳退火溫度，17條引物20份不同居群寬葉纈草共擴(kuò)增出224條條帶，其中多態(tài)性條帶194條，多態(tài)性比率86.61%，遺傳相似性系數(shù)0.4732～0.8929。
　?。?）通過UPGMA聚類分析，RAPD、ISSR兩種方法共同體現(xiàn)出4號居群樣品（劍河縣敏洞上壩；2014）單獨(dú)聚為一組，其余19份居群樣品聚為一組；不同寬葉纈草居群總體呈現(xiàn)劍河地區(qū)的聚為一組，江口地區(qū)的聚為另一

6、組；2013年份的聚為一組，2015年份的聚為另一組。
　?。?）RAPD與ISSR的相關(guān)性分析系數(shù)為0.875，在0.01水平呈顯著正相關(guān)。
　　（7）23份不同居群寬葉纈草trnL-F序列測序顯示，trnL-F序列長度947～985 bp，GC%含量為35.92～36.55%，排位后的長度為930bp，其中差異位點(diǎn)8個(gè)，變異位點(diǎn)5個(gè)，居群間的遺傳距離為0.0000～0.0054，居群總體遺傳距離為0.0005，ML、NJ

7、、ME、UPGMA四種聚類構(gòu)樹結(jié)果顯示15（江口縣官和鄉(xiāng)泗渡村寨上組）、18（江口縣凱德鎮(zhèn)育苗基地）號樣品明顯地與大部分的寬葉纈草樣品區(qū)分出來。
　　（8）23份不同居群寬葉纈草matK序列測序顯示，matK序列長度1080～1088 bp，GC%含量為35.19～36.64%，排位后長度為1055bp，差異位點(diǎn)2個(gè)，變異位點(diǎn)1個(gè)，簡約信息位點(diǎn)1個(gè)，居群間的遺傳距離為0.0000～0.0009，居群總體遺傳距離為0.0003，ML

8、、NJ、ME、UPGMA四種聚類構(gòu)樹結(jié)果顯示2（劍河縣太擁鄉(xiāng)太平村）、5（劍河縣岑松鎮(zhèn)稿旁村）、6（劍河縣關(guān)么鄉(xiāng)苗嶺村）、20（江口縣閔孝鎮(zhèn)漁涼溪村）號樣品聚為一類，其余19份聚為一類。
　?。?）寬葉纈草揮發(fā)油為外觀顯淡黃色的澄清液體，具有纈草揮發(fā)油固有的臭氣，味微苦，其酸值為2.89～4.11mg/g、皂化值為171.08～183.00mg/g、折光率為1.4728～1.4796、比旋度為39.21～58.66°。
　　

9、（10）建立了寬葉纈草揮發(fā)油薄層鑒別條件：環(huán)己烷-乙酸乙酯-冰醋酸（6:0.2:0.03）作為展開劑，硅膠G板飽和15min，5%香草醛硫酸溶液顯色，得到8～13個(gè)豐富、可辨斑點(diǎn)。
　?。?1）經(jīng)氣相色譜法考察，寬葉纈草揮發(fā)油中乙酸龍腦酯在1.0025～8.0200mg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，r2=0.9991，平均回收率98.45%，寬葉纈草揮發(fā)油中乙酸龍腦酯的含量為29.64～59.65%。
　?。?2）生長于不同海拔高度

10、的寬葉纈草揮發(fā)油中乙酸龍腦酯的含量隨海拔的增高而呈現(xiàn)增高趨勢，到一定海拔高度，呈下降趨勢，相關(guān)性分析表明寬葉纈草揮發(fā)油中乙酸龍腦酯的含量與海拔高度相關(guān)性不顯著。
　　結(jié)論：
　　（1）貴州省不同居群寬葉纈草具有較高的遺傳多樣性，所得RAPD、ISSR分子標(biāo)記可用于寬葉纈草的遺傳多樣性研究，為今后開發(fā)寬葉纈草的選種與育種奠定了基礎(chǔ)。
　　（2）貴州省寬葉纈草居群內(nèi)trnL-F、matK序列具有高度保守性。
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